[发明专利]一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法。

背景技术

超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。

百合是百合科百合属的草本植物，为世界著名的球根花卉，具有花色丰富、姿态优美的特色。百合被广泛运用在园林布景、切花、鲜花和盆栽观赏等方面。中国作为百合分布中心，种质资源丰富，但多数野生种仍属于濒危植物。百合作为多年生球茎草本，不能通过低温种子库进行保存，目前主要的保存方式为田间种植保存，易在保存过程中出现褐变、腐烂，百合的中长期保存问题亟待解决。

国外关于百合的超低温研究开始于上世纪90年代，利用百合茎尖为外植体，通过超低温保存的成活率仅为8.45％，随着对超低温体系的不断改进，在玻璃化溶液PVS2出现后，成活率显著提升，开始被应用于不同类型的材料。国内的相关研究起步较晚，已初步摸索出百合超低温保存各关键步骤的保存条件，丰富了百合超低温保存体系。但关于百合胚性愈伤组织作为材料进行超低温保存的研究还很少，还未建立百合胚性愈伤组织的超低温保存体系。因此建立百合胚性愈伤组织超低温保存体系并加以优化，提高百合胚性愈伤组织冻后存活率，对百合的研究与产业发展具有很重要的作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，以克服现有技术中植物及其组织中长期保存难以实现，以及超低温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，采用玻璃化法超低温保存的方法对百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下：

1)预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在0～10℃下预培养1～4天；

2)装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40～60分钟后移除装载液；

3)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织40～60分钟；

4)液氮保存：保持百合胚性愈伤组织在玻璃化溶液中浸泡的状态，并置于液氮中保存；

所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。

优选地，所述MS培养液含有1900mg/L KNO₃，1650mg/L NH₄NO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄·7H₂O，440mg/L CaCl₂·2H₂O，37.3mg/L Na₂-EDTA，27.8mg/LFeSO₄·7H₂O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/LCoCl₂·6H₂O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。

优选地，所述预培养的培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基。

优选地，所述预培养的培养基为含有0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基。