[发明专利]基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程和基因克隆技术领域，具体为一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用。具体步骤如下：(1)构建DNA重组酶的表达载体；(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性；(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA时生成的5’单链突出端长度，(4)验证制备的DNA重组酶生成5’单链DNA突出端的长度和基因克隆效率。本发明的有益效果在于：其制备的5’单链突出端的长度可控，维持在15‑25个核苷酸范围内，使得克隆效率和准确率达到最高，利用中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。

技术领域

本发明涉及一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的新型DNA重组酶制备方法，其可以用于构建重组DNA载体，属于蛋白质工程和基因克隆技术领域。

背景技术

基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因DNA片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。限制性核酸内切酶消化和DNA连接效果较难控制，常常造成目标基因克隆失败。同时由于限制性核酸内切酶识别位点的多样性，不同目标基因采用的限制性核酸内切酶不同，使得常规基因克隆的操作通量有限，不能进行高通量基因克隆。

为了克服常规基因克隆方法的缺陷，目前已开发了不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的克隆技术。这些克隆技术的共同点是：通过酶学或化学手段,使目标基因和线性载体DNA产生长度不低于12个核苷酸的单链突出端，且目标基因与线性载体的单链突出端互补配对，重组质粒转入大肠杆菌后，大肠杆菌负责修复目标基因与线性载体间的缺口，形成含有目标基因的完好重组载体。目前不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的克隆方法也存在明显缺点：产生单链突出端的酶学反应处于非可控状态，要么反应过度，要么反应不充分，结果单链突出端生成效率极低，不高于千分之一，需要转化效率极高的感受态细胞(高于10⁸)才能取得较满意的克隆效率。而制备高于10⁸的感受态细胞就是一项困难繁琐的技术。因此制备酶学反应可控的高效稳定的DNA重组酶，用于基因克隆将大大促进不依赖于限制性内切酶和连接酶的克隆技术与基因工程技术的发展。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶学反应可控的新型DNA重组酶的制备方法及其应用，其制备的DNA重组酶可用于基因克隆和点突变，尤其适用于高通量基因克隆。

本发明提供一种新型DNA重组酶制备方法，该新型DNA重组酶同时具有DNA聚合酶活性和3’外切酶活性，而且这两种活性经过改造后可以在生成5’单链DNA突出端的过程中达到一种平衡状态：当5’单链DNA突出端长度短于15个核苷酸时，重组酶表现为3’外切酶，继续水解3’核苷酸，从而延长5’单链DNA突出端；当5’单链DNA突出端长度长于25个核苷酸时，重组酶表现为DNA聚合酶，在3’端添加核苷酸，使5’单链DNA突出端回退到15-25个核苷酸。这种新型DNA重组酶，可以高效的使5’单链DNA突出端长度维持在15-25个核苷酸左右，从而大大提高5’单链DNA突出端生成效率；使得利用中等效率的感受态细胞(10⁴-10⁵)即可轻松的完成基因克隆。

本发明提供一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法，具体步骤如下：

第一步，构建DNA重组酶的表达载体。

选取同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利用常规基因克隆技术将原型重组酶基因克隆到原核表达载体pET28a，在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中表达原型重组酶。镍柱亲和纯化DNA重组酶，测定其DNA聚合酶和3’外切酶活性，计算3’外切酶活性/DNA聚合酶活性的比值(E/P值)。

第二步，改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性