[发明专利]基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建DNA重组酶的表达载体

选取同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型，利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达原型重组酶，镍柱亲和纯化得到DNA重组酶，测定其DNA聚合酶和3’外切酶活性，计算原型DNA重组酶的3’外切酶活性和DNA聚合酶活性的比值，即E/P值，作为改善型DNA重组酶的筛选参数；

(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性

在原型DNA重组酶基础上，利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶和3’外切酶活性的氨基酸残基，调整DNA重组酶的E/P值，设计制备一系列DNA重组酶突变体；利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS重组表达、镍柱亲和纯化得到一系列DNA重组酶突变体，测定突变体的DNA聚合酶和3’外切酶活性、计算各突变体的E/P值，以原型DNA重组酶为参照物，筛选E/P值增高的一系列DNA重组酶突变体；

(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA产生的5’单链DNA长度

人工合成长度为80个碱基对的双链DNA，以其作为底物，测定DNA重组酶突变体水解双链DNA的效果，筛选生成的5’单链突出端长度在15-25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变体为用于不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆的DNA重组酶。

2.根据权利要求1所述制备方法得到的DNA重组酶于不依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的基因克隆技术中的应用。