[发明专利]一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及柳兰悬浮细胞的快繁方法，属于植物技术领域。

背景技术

柳兰，Epilobium angustifolium Linn.，柳叶菜科，多年生草本，高约1-1.3米。茎直立，通常不分枝。叶互生，披针形，总状花序顶生，伸长，花序轴被短柔毛，苞片线形，长1-2厘米，花大，两性，红紫色。根、茎、叶、花、果均含鞣质，分布于我国西南、西北、华北至东北；北温带广布，北美洲、欧洲至日本，自然生于海拔较高的林缘、林间、山坡草地、河岸草丛及火烧或采伐迹地。耐寒。喜凉爽、湿润气候及湿润、肥沃、排水良好的土壤。稍耐阴。畏炎热、干旱的环境。柳兰全草70%丙酮提取物中分得9个鞣质类及其他酚性化合物，分别鉴定为3-氧-没食子酰基-D-葡萄糖、1，6-二-氧-没食子酰基-β-D-吡喃型葡萄糖、1-氧-没食子酰基-4，6-六羟基联苯甲酰基-β-D-吡喃型葡萄糖、水杨梅丁素、英国栎鞣花酸、特里马素、虾子花素、绿原酸、没食子酸。根状茎或全草入药，有小毒，能调经活血、消肿止痛，主治月经不调、骨折、关节扭伤。柳兰繁殖采用种子繁殖，也可分株和扦插繁殖，悬浮细胞培养还无人研究，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供柳兰悬浮细胞培养的快速繁殖方法，操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。

为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：

选用柳兰的种子，在肥皂水中浸泡30min，自来水冲洗1h，在超净工作台上用0.2％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5遍至无残留溶液，经消毒处理后的外植体，去掉外种皮接种在1/2WPM+NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.5-1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织的条件为暗光照，光照10h/d，温度21℃，30天后，将诱导出来的愈伤组织接入培养基WPM+1-2mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L2,4-D+150mg/L番茄汁培养基中进行继代培养，继代培养40天后，挑选嫩绿松散的愈伤组织，放入附加了150mg/L红色红曲酶的培养液体培养基中，加入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇，置于震荡培养箱中进行水平震荡培养，振幅2-4cm，震动频率90r/min，温度23℃，光照2500lx，光期12h/d，7-8天继代一次，取样，洗涤，烘干。

采用本发明制备的柳兰悬浮细胞，工艺流程简单，生产周期短，不受地域，季节，气候等自然环境因素影响等优点，有利于建立柳兰悬浮细胞的大规模工厂化生产。

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式

实施例1

选用柳兰的种子，在肥皂水中浸泡30min，自来水冲洗1h，在超净工作台上用0.2％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5遍至无残留溶液，经消毒处理后的外植体，去掉外种皮接种在1/2WPM+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织的条件为暗光照，光照10h/d，温度21℃，30天后，将诱导出来的愈伤组织接入培养基WPM+1mg/L6-BA+0.3mg/L2,4-D+150mg/L番茄汁培养基中进行继代培养，继代培养40天后，挑选嫩绿松散的愈伤组织，放入附加了150mg/L红色红曲酶的培养液体培养基中，加入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇，置于震荡培养箱中进行水平震荡培养，振幅2-4cm，震动频率90r/min，温度23℃，光照2500lx，光期12h/d，7-8天继代一次，取样，洗涤，烘干，成活率为90%。

实施例2

选用柳兰的种子，在肥皂水中浸泡30min，自来水冲洗1h，在超净工作台上用0.2％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5遍至无残留溶液，经消毒处理后的外植体，去掉外种皮接种在1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织的条件为暗光照，光照10h/d，温度21℃，30天后，将诱导出来的愈伤组织接入培养基WPM+2mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+150mg/L番茄汁培养基中进行继代培养，继代培养40天后，挑选嫩绿松散的愈伤组织，放入附加了150mg/L红色红曲酶的培养液体培养基中，加入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇，置于震荡培养箱中进行水平震荡培养，振幅2-4cm，震动频率90r/min，温度23℃，光照2500lx，光期12h/d，7-8天继代一次，取样，洗涤，烘干，成活率为91%。

实施例3

选用柳兰的种子，在肥皂水中浸泡30min，自来水冲洗1h，在超净工作台上用0.2％的升汞消毒15min，无菌水冲洗5遍至无残留溶液，经消毒处理后的外植体，去掉外种皮接种在1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织的条件为暗光照，光照10h/d，温度21℃，30天后，将诱导出来的愈伤组织接入培养基WPM+2mg/L6-BA+0.3mg/L2,4-D+150mg/L番茄汁培养基中进行继代培养，继代培养40天后，挑选嫩绿松散的愈伤组织，放入附加了150mg/L红色红曲酶的培养液体培养基中，加入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇，置于震荡培养箱中进行水平震荡培养，振幅2-4cm，震动频率90r/min，温度23℃，光照2500lx，光期12h/d，7-8天继代一次，取样，洗涤，烘干，成活率为92%。