[发明专利]一种矮牵牛染色体的制片方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种矮牵牛染色体的制片方法。

背景技术

矮牵牛（Petunia hybrida Vilm.)原产于南美洲，又名碧冬茄为茄科碧冬茄属植物，花朵硕大、色彩丰富，花型变化颇多，在国际上早已成为主要的盆花和装饰植物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为“世界花坛花卉之王”。矮牵牛在美国栽培十分普遍，常用在窗台美化、城市景观布置，其生产的规模和数量列美国花坛和庭园植物的第二位；在欧洲的意大利、法国、西班牙、荷兰和德国等国，矮牵牛广泛用于街旁美化和家庭装饰；在日本，矮牵牛常用于各式栽植槽的布置和公共场所的景观配置。我国矮牵牛于20世纪初开始引种栽培，仅在大城市有零星栽培，直到80年代初，开始从美国、荷兰、日本等国引进，作为花坛后起之秀市场对矮牵牛需求越来越大，栽培范围越来越广泛现在已成为一种重要花卉，普遍用于花坛、广场等装饰与绿化，对其进行品种选育和细胞遗传学等相关研究具有重要意义。

远源杂交、倍性育种是植物遗传育种的重要方法，都需要对染色体的遗传行为进行观察和分析，需要提供高质量的染色体图片，优良的细胞染色体制片方法是进行染色体核型分析、染色体识别等研究的基础。

现有的染色体制片方法，根尖一般是观察有丝分裂最常用的材料，取材时根尖长度很关键，根尖过长绝大部分细胞已经过了有丝分裂期，根尖过短则处于有丝分裂前期，需要大量种子进行发芽培养试验，对无种子或种子稀少材料不适宜，且试验过程繁琐周期长。对花卉植物而言，开花期长大量花蕾雌蕊很容易得到无需专门的培养，缩短了试验周期简化了试验流程。幼小花蕾如取材大小适宜，其细胞有丝分裂指数(视野内观察到的有丝分裂细胞数目/视野内观察到的总细胞数目×100%)往往高于根尖。单利用矮牵牛花蕾雌蕊进行染色体制片目前还未有报道。

有丝分裂中期时染色体浓缩变粗，能够显示出该物种所特有的染色体数目和形态，有丝分裂中期适于做染色体的形态结构分析和计数，但中期时间较短不易观察。预处理通过破坏纺锤丝的形成获得更多的中期分裂相，还促使染色体染色体缩短和分散便于观察，预处理方法主要有低温处理和化学药剂处理。现有资料中仅有蔡华等在《生物学通报》2006年41卷第4期49-50页发表的《观赏花卉矮牵牛与野生牵牛花的染色体核型比较》中报道采用8-羟基喹啉预处理矮牵牛根尖，按照此方法以雌蕊柱头为材料重复试验，中期分裂指数(视野内观察到的有丝分裂中期细胞数目/视野内观察到的总细胞数目×100%)偏低。

植物细胞依靠细胞壁和胞间连相连接，为了得到分散良好的有丝分裂中期分裂相，常采取盐酸解离方法，不同植物材料盐酸解离时间不尽相同，处理时间短细胞壁消除不完全导致细胞分散不开，解离时间长对染色体结构破坏严重、染色效果差。

发明内容

为了克服现有矮牵牛染色体制片技术的不足，本发明的目的在于提供了一种二、四倍体矮牵牛染色体制片方法，该方法以幼小花蕾雌蕊柱头作为材料，获得的染色体分散均匀、背景浅、易观察到染色体数目和形态。

本发明所采用的技术方案为：一种矮牵牛染色体染色体的制片方法，该方法包括如下步骤：

（1）于晴天早晨8:00-10:00取二倍体、四倍体矮牵牛长度分别为3~6mm和5~8mm的不包含萼片的幼蕾；

（2）分别将二、四倍体矮牵牛幼蕾分开放置于0.002mol.L^-1 8-羟基喹啉水溶液中2-6℃低温避光预处理3小时，蒸馏水冲洗3-5次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定12-24小时，经体积浓度95%、体积浓度80%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度70%乙醇中4℃保存备用；

（3）将步骤（2）中备用的幼蕾先用蒸馏水冲洗3-5次，再用吸水纸吸干水，再经0.075mol.L^-1氯化钾溶液进行低渗10分钟，在1 mol.L^-1HCl溶液60℃水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3-5次后蒸馏水低渗30分钟，吸水纸吸干水；

（4）转入体积百分浓度为45%的醋酸溶液配制的质量浓度为1%的洋红染色液中，在2-6℃低温下染色12-24小时；