[发明专利]一种降糖稳糖酵母菌粉及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种降糖稳糖酵母菌粉，其特征在于，所述的酵母菌表达有GLP-1，并含有由无机铬、无机硒和无机钒转化形成的葡萄糖耐量因子、酵母硒和酵母钒；

所述的酵母菌表达的GLP-1为定点突变的GLP-1，其第二位的丙氨酸残基突变为甘氨酸残基；突变后的GLP-1的氨基酸残基序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述的酵母菌是在甲醇诱导下进行的液体发酵：其培养基中还添加有15～25mg/L的无机铬、5～15mg/L的无机硒和10～30mg/L的无机钒；接种并扩增培养24小时后，流加0.5-1ml/min甲醇诱导进行发酵表达，并等量流加山梨醇，山梨醇中添加有30～40mg/L的无机铬、12～15mg/L的无机硒和30～40mg/L的无机钒。

2.如权利要求1所述的降糖稳糖酵母菌粉，其特征在于，所述的酵母菌为重组的酵母菌，以酵母作为宿主细胞，克隆入包含如SEQ.ID.NO.2所示序列的表达载体。

3.如权利要求2所述的降糖稳糖酵母菌粉，其特征在于，所述的宿主细胞为GS115毕赤酵母菌或SMD-1168毕赤酵母菌，所述的表达载体为pPIC9K载体，SEQ.ID.NO.2所示序列克隆在pPIC9K载体α因子信号肽的下游。

4.一种降糖稳糖酵母菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1）合成如SEQ.ID.NO.2所示的GLP-1基因序列，并将其克隆入表达载体中，构建成GLP-1重组表达载体；

2）将GLP-1重组表达载体线性化后转化到酵母细胞中，获得GLP-1重组酵母；

3）将GLP-1重组酵母接种于发酵罐中的培养基上，其中培养基上还添加有无机铬盐、无机硒盐和无机钒盐；

在扩增培养24小时后，流加甲醇诱导发酵表达，同时流加与甲醇等量的山梨醇，山梨醇中含有无机铬盐、无机硒盐和无机钒盐；

4）诱导表达发酵完成后，离心收集酵母菌，并充分洗涤；抽真空烘烤过夜，得到细胞内含重组GLP-1、葡萄糖耐量因子、酵母硒、和酵母钒的降糖稳糖酵母菌粉。

5.如权利要求4所述的降糖稳糖酵母菌粉的制备方法，其特征在于，所述的GLP-1基因是基于以下引物并采用融合PCR的方法拼接而成的，所述的引物为：

GLP-F1: 5’ tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtg 3’；

GLP-R1: 5’ tccaaataagaacttacatcactggtaaaggtccc 3’；

GLP-R2: 5’ tccttggcagcttggccttccaaataagaacttac 3’；

GLP-R3: 5’ accagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’；

GLP-R4: 5’ atgcggccgctcggcctttcaccagccaagcaatg 3’；

所述的GLP-1重组表达载体是将GLP-1基因序列克隆入pPIC9K载体α因子信号肽的下游而获得的；

所述的酵母为GS115毕赤酵母菌或SMD-1168毕赤酵母菌。

6.如权利要求4所述的降糖稳糖酵母菌粉的制备方法，其特征在于，所述的培养基为BSM无机培养基，其中还添加有15～25mg/L的无机铬、5～15mg/L的无机硒和10～30mg/L的无机钒；培养基配置完成后，添加氨水调或硫酸铵调pH为5.0，诱导表达前调pH为6.0；

所述的山梨醇中添加有30～40mg/L的无机铬、12～15mg/L的无机硒和30～40mg/L的无机钒。

7.权利要求1所述的降糖稳糖酵母菌粉在制备降低血糖、稳定血糖的药物或制剂中的应用。

8.权利要求1所述的降糖稳糖酵母菌粉在制备治疗Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。