[发明专利]一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶学和生物分析技术领域，具体涉及一种特异性探针底物组合物及其应用，尤其涉及一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用。

背景技术

细胞色素P450(CYP450)酶分布于肝脏、小肠和肾脏，其中CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4等亚型与外源性物质(如药物)代谢清除密切相关，参与90％的药物代谢。在新药研发过程中，可以通过这些CYP450酶的探针底物在体外代谢体系(如人肝微粒体等)生成特异性代谢产物的速率，判断药物是否会抑制特定的CYP酶亚型，进而推断该药物是否会引起体内药物间相互作用，降低药效或增加毒性。

近年来，对高通量药物筛选的需求日益增加，目前，用于研究CYP活性的方法主要中，“cocktail”探针药物法较为常见，但其仍有很多不足之处，如构成该cocktail的几种药物在共同孵育时可能存在着相互作用，而且对分析方法的灵敏度和特异性要求较高，这样就会提高分析成本。

随着组合化学和高通量筛选手段的采用，需要进行CYP450酶抑制作用筛选的化合物急剧增多，而目前由于分析方法(如高效液相、紫外或荧光)的灵敏度限制，每次分析仅能预测化合物对单个酶的抑制作用，耗时低效。

因此，寻找一种可靠的混合探针底物和高灵敏度的分析方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性探针底物组合物及其应用，特别是一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细胞色素P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成。本发明的特异性探针底物组合物例如可以是：非那西丁与香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸或睾酮中任意一种或至少两种的组合，或者，香豆素与非那西丁、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸或睾酮中任意一种或至少两种的组合等等，优选为非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮的组合物。

其中，所述非那西丁的浓度为7.5-30μM，例如可以是：7.5μM、8.5μM、10.5μM、12.5μM、15μM、18μM、20μM、23μM、25μM、30μM，优选为15-25μM，更优选为15μM。

所述香豆素的浓度为1.25-5μM，例如可以是1.25μM、1.5μM、2.0μM、2.25μM、2.5μM、2.75μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，优选为1.25-3.5μM，更优选为2.5μM。

所述安非他酮的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.75μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述右美沙芬的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述双氯酚酸的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述睾酮的浓度为5-20μM，例如可以是5μM、6.5μM、8μM、10μM、12μM、15μM、16μM、17μM、18μM、20μM，优选为8-18μM，更优选为10μM。

第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物在检测细胞色素P450酶6种亚型酶活性的应用。

本发明的细胞色素P450酶可以是来源于肝、肾和胃肠道等含有P450酶的细胞和亚细胞器，如肝细胞、微粒体和S9等。

作为优选技术方案，本发明的应用包括利用如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物检测细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用。

在进行检测时，可以结合液相色谱-质谱联用技术同时进行，或者采用高效液相色谱等检测手段，都可以实现对细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用。