[发明专利]植物叶片总RNA提取方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种富含多糖多酚的植物叶片总RNA提取方法。植物材料经液氮研磨后，经连续两次裂解，水饱和酚与氯仿混合溶液抽提，异丙醇沉淀得到总RNA。本发明的有益效果在于：1、连续两次裂解，有效克服多糖、多酚、次生代谢物对RNA提取过程的影响，2、无需水浴，减少RNase污染，3、无需使用低温离心机，操作方便，4、本方法有效避免传统沉淀方法中LiCl残留对下游实验的影响，所提取的RNA可以满足反转录PCR和实时荧光定量PCR等后续分子生物学实验。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种富含多糖多酚的植物叶片总RNA提取的方法。

背景技术

从植物组织中提取高质量的总RNA对于基因克隆及其功能鉴定、基因的表达和调控分析、分子标记辅助育种等具有重要意义[1]。

从植物组织中提取高质量的总RNA存在困难。植物体内富含多糖多酚，在RNA提取过程中，细胞破碎后多糖多酚物质与RNA发生作用。酚类化合物极易被氧化，生成物(如醌类)能与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失，用苯酚、氯仿抽提时RNA丢失[2]，从而影响RNA的分离纯化；多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来[3]；多糖还可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA无法用于进一步的分子生物学研究；RNase会造成RNA的化学降解和酶解，RNA提取过程中污染的RNA酶有两种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源性RNA酶来自RNA制备过程中使用的玻璃、塑料制品和试剂及操作人员本身等，而内源性RNA酶是组织本身所固有的，当细胞破碎后即释放出来。因此，能否有效去除多糖、酚类化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高质量RNA成败的关键[4]。

现成的提取植物材料总RNA的方法对除多糖、酚类化合物及去除或抑制 RNA酶活性等亟需改良。目前，常见植物材料总RNA的方法主要有SDS法、CTAB法、异硫氰酸胍法[5]、热硼酸法[6]、商业化试剂盒Trizol[7]等，但对于多糖、多酚、次生代谢物较多的植物组织RNA的提取效果并不理想，阻碍了其分子生物学方面研究的进展[8]。我们迫切需要一种成本低廉，操作简单、方便，就能彻底除去材料中的蛋白质、DNA、多糖、多酚等有机类物质的提取方法。

发明内容

本发明目的是为了解决现有RNA提取方法对多糖、多酚、次生代谢物较多的植物组织RNA提取效果较差的缺陷，提供一种能彻底除去植物材料中蛋白质、DNA、多糖、多酚、以及次生代谢产物等有机类物质的总RNA提取方法。本方法所提取的RNA可满足反转录PCR和实时荧光定量PCR等研究的需要，同时大大降低实验的成本。

本发明为解决上述问题，提供一种新的植物叶片总RNA提取方法，其包括以下步骤：

(1)植物叶片在液氮环境下研磨成细粉状，快速转移到含有细胞裂解液I的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后离心；

(2)转移上清液到含有细胞裂解液II的离心管中，混匀后加入盐-醇溶液混匀后离心；

(3)转移上清液到新离心管中，经等体积的水饱和酚与氯仿组成的混合试剂抽提后离心；

(4)取上清液，加入异丙醇沉淀离心，加DEPC水(灭菌过的0.1％DEPC水简称DEPC水))溶解总核酸，再用DNA酶I溶液消化DNA；

(5)经等体积氯仿抽提离心；

(6)转上清液到新的离心管，加入异丙醇沉淀离心；

(7)用醇洗涤，再经空气干燥后，溶解在DEPC水中低温保存。