[发明专利]高内涵图像流式生物显微分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及流式细胞术，具体地，涉及高内涵图像流式生物显微分析方法。

背景技术

流式细胞术是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。使用传统的流式细胞检测技术，研究人员可以分析成千上万个细胞，获得每个细胞的散射光信号和荧光信号的数值，从而得到细胞群体的各种统计数据，并可以找到稀有的细胞亚群。

但是传统流式细胞检测技术仍然存在局限，那就是获得的细胞信息很有限。细胞对研究人员来说，只是散点图上的一个点，而不是真实的细胞图像，缺乏细胞形态学、细胞结构及亚细胞水平信号分布的相关信息。要想获得细胞图像，研究人员就必须使用显微镜进行观察，但显微镜能够观察的细胞数量是非常有限的，很难提供细胞群体的量化与统计数据。因此，使用传统的细胞分析技术，我们就只能面对这样的两难选择，没有一种技术可以既提供细胞群体的统计数据，又获得细胞图像。

发明内容

针对目前现有技术中单个流式细胞仪存在的缺陷，本发明的目的是设计一个合理的光学成像系统，其中，能高速采集经过鞘液室的单个细胞明场和荧光图像是设计的重点，这样既可以利用明场图像来观察细胞的形态特征，又可以利用荧光来测定细胞中的关键成分，实现流式细胞术和显微成像的有机结合。

根据本发明提供的一种高内涵图像流式生物显微分析方法，包括如下步骤：

步骤1：搭建高内涵图像流式生物显微分析系统；

步骤2：利用所述高内涵图像流式生物显微分析系统对细胞进行检测；

所述高内涵图像流式生物显微分析系统包括：液流系统、光学系统；

液流系统包括流动室，流动室用于接收注入的样本细胞悬液和系统鞘液中，并使样本细胞悬液中的细胞在系统鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过流动室的检测窗口；

光学系统包括光源、光路系统、滤光片堆栈；

所述光源，用于照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号；光源包括用于产生明场细胞图像的卤素灯、用于产生荧光细胞图像的激光器；

光源照射细胞产生的光信号被物镜收集，通过两组楔形光栅分别收集前向光信号、侧向光信号到两个TDI相机中，然后通过光路系统传递到主要由多个二向色镜构成的滤光片堆栈，光信号在滤光片堆栈处被分成不同波段投射到一个六通道PMT阵列上；进而所述光学系统产生一个明场细胞图像，一个六通道荧光细胞图像及六个不同波段的PMT光强信号。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括激光补光装置，其中，所述激光补光装置用于通过在细胞侧向补光来调整光强度，降低TDI相机延迟积分的时间，减少细胞的高速流动带来的积分时间过短造成光强偏弱的缺陷。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括自动对焦装置，其中，所述自动对焦装置用于利用激光光点法，通过测量弥散斑的边缘和尺寸来计算细胞的聚焦位置。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括速度测量装置，其中，所述速度测量装置用于利用激光测距来测定限定时间内细胞的运动距离，折算出细胞的运动速率。所述TDI相机根据细胞的运动速率捕获在流动室内的单细胞的图像。

优选地，所述高内涵图像流式生物显微分析系统还包括分析系统，其中，所述分析系统采用荧光和明场的图像配准方式，校正荧光和明场的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通过多光谱PMT光信号和多光谱的荧光图像来校正图像的荧光强度，使得输出的荧光强度与PMT保持一致。

优选地，所述分析系统通过PMT光信号来调节荧光图像的分割阈值，并且通过图像微观结构的分析来确定大量细胞中的异常细胞。

优选地，所述物镜的孔径数值NA大于0.75。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

2、本发明将流式细胞术与荧光显微成像结合于一身，它具有多个检测通道，能够对通过流动室的细胞逐个采集的细胞图像，并利用分析软件对每个细胞图像进行量化分析，从而提供细胞群的统计数据以及细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

3、本发明可以用于细胞信号转导/通路分析、细胞间相互作用、分子共定位与胞内分子转运、细胞形态学、荧光原位杂交、基因表达分析、细胞凋亡、细胞周期分析、白细胞亚群分析。

附图说明