[发明专利]用于测定食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的存在或不存在的方法

说明书

本发明涉及将在短时间段内产生关于食物样品中的致病性STEC(产志贺毒素大肠杆菌)的存在或不存在的可靠结果的方法。该方法包括‑使食物样品在允许大肠杆菌生长的培养基中温育，以获得大肠杆菌储液培养基；‑执行储液培养基中的大肠杆菌裂解，以获得包含大肠杆菌DNA的样品溶液；和‑使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对样品溶液实施第一系列的聚合酶链反应(PCR)：分别编码志贺毒素1和志贺毒素2的stx1和/或stx2，对于待测定的每个STEC血清群，编码紧密粘附素的该血清群的eae基因的亚型，和对于待测定的每个STEC血清群，对于该血清群特异性的生物标记基因；并且在第一系列的PCR中扩增stx1和/或stx2以及至少一个血清群的eae基因和特异性生物标记基因的情况下：‑通过对大肠杆菌储液培养基的浓缩物执行第二系列的PCR，和任选地，对衍生自浓缩物的单一大肠杆菌菌落执行第三系列的PCR，验证STEC的一个或多个特异性血清群的存在。

发明领域

本发明涉及用于测定食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli)(STEC)的存在或不存在的方法，在此类方法中使用的反应盒，以及容纳反应盒的仪器。

发明背景

在STEC的菌株中，已鉴定了与人的严重疾病相关的七个血清群，即O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。这些血清群在下文中被称为STEC Top7。美国农业部(UnitedStates Department of Agriculture)(USDA)已实施可应用于某些生牛肉产品的分析的法规，该法规将除血清群O157之外的如上鉴定的六种其他血清群定义为掺杂物。

当测定这些STEC菌株的存在或不存在时，通常将食物样品加入允许大肠杆菌生长的培养基中，以提供大肠杆菌储液培养基。

随后，储液培养基中的大肠杆菌的裂解提供了包含大肠杆菌DNA的样品溶液。

使用常规方法以可靠方式在样品中对上述血清群的后续检测是耗时操作。

在ISO13136技术规范(ISO/TS13136:2012)中阐述使用聚合酶链反应(PCR)用于检测主要STEC毒力基因stx1、stx2、eae和血清群特异性基因。PCR阳性样品必须通过培养方法加以证实，因为不同的基因可以属于不同的菌株，导致假阳性结果。

发明概述

本发明的目的是提供在更短的时间段内产生关于食物样品中致病性STEC的存在或不存在的可靠结果的方法。

这个目的通过如权利要求1中所述的方法得到解决。

令人惊讶的是，由于其特定的工作流程，根据本发明的方法允许假阳性结果率的降低以及菌落分离的优化。由此可以显著简化食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的一个或多个特异性血清群的存在或不存在的测定。

更具体而言，本发明提供了以非常有时间效率的方式用于鉴定和证实食物样品中高致病性STEC的存在或不存在的方法，在所述方法中，通过使食物样品在培养基中温育而获得大肠杆菌储液培养基以及裂解储液培养基中含有的大肠杆菌后，对这种含DNA的样品溶液实施使用特异性引物的第一系列的PCR反应。这可以称为第一筛选步骤。该第一筛选步骤允许同时检测编码志贺毒素的stx1和/或stx2毒力基因、编码与一个或多个血清群特异性相关的紧密粘附素(intimin)的eae亚型、以及每个血清群的生物标记基因。

随后，假定的阳性标品将必须加以证实。

eae亚型的检测允许基本上减少假阳性样品的数目。

在优选实施方案中，对阳性样品实施第二筛选步骤，其中衍生自大肠杆菌储液培养基的免疫浓缩物再一次在PCR分析中进行检查。

在该第二筛选步骤获得阳性结果的情况下，将免疫浓缩物的部分在显色培养基上铺平板，以将各自STEC菌株分离为菌落。