[发明专利]用于测定食物样品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的存在或不存在的方法

权利要求书

1.一种用于测定食物样品中致病性产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的一个或多个特异性血清群的存在或不存在的方法，其包括

-使所述食物样品在允许大肠杆菌生长的培养基中温育，以获得大肠杆菌储液培养基；

-执行所述储液培养基中的大肠杆菌裂解，以获得包含大肠杆菌DNA的样品溶液；和

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对所述样品溶液实施第一系列的聚合酶链式反应(PCR)：

●分别编码志贺毒素1和志贺毒素2的stx1和/或stx2，

●对于待测定的每个STEC血清群，编码紧密粘附素的该血清群的eae基因的亚型，和

●对于待测定的每个STEC血清群，对于该血清群特异性的生物标记基因；

并且在第一系列的PCR中扩增stx1和/或stx2以及至少一个血清群的所述eae基因和所述特异性生物标记基因的情况下：

-通过对大肠杆菌储液培养基的浓缩物执行第二系列的PCR，和任选地，对衍生自所述浓缩物的单一大肠杆菌菌落执行第三系列的PCR，以验证STEC的一个或多个特异性血清群的存在，

其中对STEC的一个或多个特异性血清群的存在的验证包括

-使用针对所述各自血清群的STEC的抗体，执行关于每个血清群的所述大肠杆菌储液培养基的免疫浓缩；

-从所述免疫浓缩物中分离DNA；和

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对所述DNA实施第二系列的PCR：

●stx1和/或stx2，

●所述各自血清群的eae基因的亚型，和

●任选地，对于所述各自血清群特异性的生物标记基因。

2.权利要求1的方法，其中在所述第二系列的PCR中扩增stx1和/或stx2以及eae基因的情况下，存在STEC的一个或多个特异性血清群的验证进一步包括：

-在显色培养基上铺平板所述免疫浓缩物，以允许分离的大肠杆菌菌落的生长；

-从所述分离的菌落中分离DNA；和

-使用扩增下述大肠杆菌基因或其片段的引物，对所述DNA实施第三系列的PCR：

●stx1和/或stx2，

●所述各自血清群的eae基因的亚型，和

●任选地，对于所述各自血清群特异性的生物标记基因。

3.权利要求1或2的方法，其中用特异性标记的DNA探针执行所述系列的PCR，以允许检测所述扩增的基因或片段。

4.权利要求1或2的方法，其中待测定的一个或多个特异性血清群选自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。

5.权利要求4的方法，其包括测定所有血清群O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145的存在或不存在。

6.权利要求4的方法，其中待在所述系列的PCR中扩增的所述eae基因的亚型选自关于O26的eaeβ，关于O145和O157的eaeγ，关于O45、O103和O121的eaeε，以及关于O111的eaeθ。

7.权利要求1或2的方法，其中所述特异性生物标记基因选自所述各自血清群的O-抗原转运蛋白基因。

8.权利要求1或2的方法，其中所述食物样品选自生肉、生乳制品或生蔬菜制品。

9.权利要求1或2的方法，其中所述食物样品选自生牛肉或芽。

10.权利要求1或2的方法，其中用于所述温育步骤的所述培养基选自缓冲蛋白胨水，任选包含吖啶黄素；和胰蛋白酶大豆培养汤，任选包含新生霉素。

11.权利要求1或2的方法，其中用于所述温育步骤的所述培养基是经修饰的胰蛋白酶大豆培养汤，任选包含新生霉素。

12.权利要求1或2的方法，其中所述每个系列的PCR优选以自动化方式同时执行。

13.权利要求2的方法，其中所述显色培养基选自头孢克肟-亚碲酸盐山梨糖醇麦康凯；含有新生霉素、头孢克肟三水合物和亚碲酸钾的改良彩虹琼脂；胰蛋白胨胆汁X葡糖苷酸培养基；和头孢克肟-亚碲酸盐鼠李糖麦康凯。