[发明专利]一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法

说明书

技术领域

一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶，EC2.4.1.19)是一种能够催化淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物而获得环糊精的胞外酶，可分为α-，β-和γ-三种类型。环糊精分子具有独特的疏水空腔结构，能包合疏水性客体分子，因此在食品、医药、农业等领域具有广泛的应用。环糊精的工业化生产均采用酶法合成，在环糊精研究的早期，由于没有筛选出高效生产CGT酶的菌株而导致环糊精的生产率很低，环糊精的应用受到很大限制。目前，国外对CGT酶的研究较多，而我国对此酶的研究尚处于起步阶段，基因工程菌的研究不多。

为了克服天然菌株的低CGT酶生产能力，利用DNA重组技术将CGT酶编码基因导入大肠杆菌和枯草杆菌中过量表达被认为是最有效途径之一。虽然关于外源蛋白表达的研究枯草杆菌还远远落后于大肠杆菌，但是枯草杆菌属于食品工业安全宿主菌，能将蛋白直接分泌到胞外，在食品基因工程的研究中具有重要的意义。随着基因工程的飞速发展，相信枯草杆菌表达系统将更加完善，成为原核蛋白表达的最佳宿主之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法。

本发明的技术方案：

一种利用枯草杆菌生产重组α-CGT酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建软化芽孢杆菌α-CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌；

(2)优化发酵条件得到培养基关键组分麦芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳浓度分别为：15.5g/L，13g/L和20g/L，将重组枯草杆菌接种于该培养基，摇瓶培养36h后离心收集上清液。

其中步骤(1)的方法为：

I.克隆cgt基因及其自身信号肽的片段：

以P.macerans JFB05-01(菌种保藏在国家典型微生物保藏中心，保藏号：CCTCC M203062)基因组DNA为模板，以P1,P2为引物扩增得到cgt基因及其自身信号肽的片段；

正向引物P1：5′-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3′(含EcoR I酶切位点)

反向引物P2：5′-CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3′(含BamH I酶切位点)

PCR反应体系：dNTPs 5μL，10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5μL，正向引物P1(10μM)1μL，反向引物P2(10μM)1μL，模板1μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加入ddH2O补足50μL。

PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2.2min，30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到目的基因PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8-10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定。

II.构建重组质粒pGJ-cgt：

用于构建表达载体的质粒是pGJ103，含麦芽糖诱导型启动子，将该质粒和扩增的目的基因进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物割胶回收后再用T4连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的重组质粒pGJ-cgt。

III.构建含重组质粒pGJ-cgt的枯草杆菌基因工程菌：

将重组质粒pGJ-cgt转化枯草杆菌WB600得到含有软化芽孢杆菌α-CGT酶基因的重组枯草杆菌基因工程菌。

步骤(2)中诱导剂麦芽糖的最佳浓度为15.5g/L。

步骤(2)中碳源为玉米淀粉，最佳浓度为13g/L。

步骤(2)中氮源为酵母粉，最佳浓度为20g/L。

本发明从食品工业安全宿主菌为出发点，构建了软化芽孢杆菌α-CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌，采用单因素实验确定显著影响因子，并采用响应面中心组成实验法研究显著影响因子的交互作用并确定各因子的最佳组合，寻找到基因工程菌发酵产酶的最佳条件，在该最佳条件下，重组酶活性为17.6U/mL，对早日实现枯草杆菌生产CGT酶以满足其在食品中的应用具有积极意义。

具体实施方式