[发明专利]一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法

权利要求书

1.一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建软化芽孢杆菌α-CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌；

(2)优化发酵条件得到培养基关键组分麦芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳浓度分别为：15.5g/L，13g/L和20g/L，将重组枯草杆菌接种于该培养基，摇瓶培养36h后离心收集上清液。

2.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组α-CGT酶的方法，其特征在于步骤(1)构建含有软化芽孢杆菌α-CGT酶基因cgt的重组枯草杆菌基因工程菌的方法为：

I.克隆cgt基因及其自身信号肽的片段：

以软化芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01为模板，以P1,P2为引物扩增得到cgt基因及其自身信号肽的片段；

正向引物P1：5′-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3′(含EcoR I酶切位点)

反向引物P2：5′-CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3′(含BamH I酶切位点)

PCR反应体系：dNTPs 5μL，10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5μL，正向引物P1(10μM)1μL，反向引物P2(10μM)1μL，模板1μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.25μL，加入ddH2O补足50μL。

PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2.2min，30个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到目的基因PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8-10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定。

II.构建重组质粒pGJ-cgt：

用于构建表达载体的质粒是pGJ103，含麦芽糖诱导型启动子，将该质粒和扩增的目的基因进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物割胶回收后再用T4连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的重组质粒pGJ-cgt；

III.构建含重组质粒pGJ-cgt的枯草杆菌基因工程菌：

将重组质粒pGJ-cgt转化枯草杆菌WB600得到含有软化芽孢杆菌α-CGT酶基因的重组枯草杆菌基因工程菌。

3.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组α-CGT酶的方法，其特征在于步骤(2)中诱导剂麦芽糖的最佳浓度为15.5g/L。

4.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组α-CGT酶的方法，其特征在于步骤(2)中碳源为玉米淀粉，最佳浓度为13g/L。

5.根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组α-CGT酶的方法，其特征在于步骤(2)中氮源为酵母粉，最佳浓度为20g/L。