[发明专利]转基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁侧序列、其扩增引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种转基因水稻品系134Bt外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。此外，本发明还涉及所述旁侧序列和引物进行转基因水稻品系检测或鉴定的方法和试剂盒。 

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系获准环境释放。对此，需要对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展。例如对转基因植物进行转化事件特异性的检测。 

转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物转化事件特异性检测方法的重要技术资料。目前已经有部分专利和文献报道了关于转基因植物外源插入载体旁侧序列，如张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米品系的特异性检测方法；杨永义等分析了转基因水稻品系223f-S21的外源插入片段的旁侧序列，并进一步建立了转基因系特异性PCR的检测方法，张秀杰等公开了转基因水稻PA110-5品系特异性PCR定性检测引物及定性检测方法和试剂盒。 

水稻品系134Bt是利用农杆菌介导的遗传转化方法，将人工改造后的cry1Ac1基因(GENBANK登记号：AY126450)导入江浙沪地区目前广泛种植的高产优质粳稻品种“秀水134”中，通过分子手段筛选出具有cry1Ac1转录活性的单拷贝的、整合了完整目的基因且T-DNA插入位点未打断已知功能基因的独立转化体，并通过后代自交分离筛选获得纯系。但是，到目前为止，尚未建立关于转抗虫基因134Bt品系的特异性PCR检测方法。 

发明内容

针对上述技术问题，本发明的一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，并针对该旁侧序列提供对其进行特异性检测的DNA序列，例如PCR扩增引物序列。本发明的另一个目的为提供所述旁侧序列和引物的应用，包括提供旁侧序列或引物在检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途，或者制备检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分的试剂盒中的用途。此外，本发明的又一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的检测方法。 

本发明的转基因水稻品系134Bt按如下方式获得： 

取授粉后12-15天的未成熟的秀水134水稻种子经70％乙醇表明消毒1分钟，于NaClO溶液中(体积比1:4，加2-3滴吐温20)消毒90分钟，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种于N6培养基上诱导愈伤组织，置于28℃，暗室培养，5天后获得的初生愈伤组织用于转化。 

菌液的准备具体为：含pZTRT-Bt质粒(T-DNA结构域见图1，其构建参见Eun Hye Kim等人，Chloroplast-targeted expression of synthetic cry1Ac in transgenic rice as an alternative strategy for increased pest protection,Planta(2009)230:397–405)的农杆菌离心收集后用含200μM的乙酰丁香酮(AS)AA液体培养基悬浮(简称AA-AS)；超净工作台上将幼胚诱导的初生愈伤组织置于农杆菌AA-AS悬浮液中20min，期间不断摇动；倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上风干5～10min；然后，转移至表面以无菌滤纸覆盖的CC-AS(200μM)共培养培养基中，28℃黑暗条件下培养50～55小时；共培养后的愈伤组织转移到含2.0mg/L的2,4-D和500mg/L头孢霉素的N6抑菌培养基中，使愈伤组织恢复3～4天；愈伤组织转移到含2.0mg/L的2,4-D、500mg/L头孢霉素和5mg/L Basta的N6筛选培养基上继代培养3-4次就可以获得抗性愈伤组织；抗性愈伤组织转移到再生培养基获得转基因植株；再生植株转移到Yoshida营养液中水培过渡，后移栽入大田或温室土培直到成熟，共获得12个独立转化体。