[发明专利]一种N‑糖链固相富集并质谱分析的方法

说明书

技术领域

本发明属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及一种N-糖链衍生、固相富集并质谱分析的方法。本发明方法能显著地提高N-糖链质谱分析的选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。

背景技术

蛋白质N-糖基化是生物体内普遍存在的一种翻译后修饰，据研究报道，生物体内约有1/2以上的蛋白质会发生N-糖基化。糖蛋白的N-糖链具有重要的生物学功能，在细胞识别和分子识别，蛋白质折叠，维持蛋白质正确构象中起到重要作用。研究同时表明，许多重大疾病的发生发展往往伴随着N-糖链组成、结构等的改变。高灵敏地鉴定生物体内的N-糖链是进一步研究其组成和结构的首要前提。然而，N-糖链研究面临着如下困难：首先，糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度通常较低，因此，N-糖链的含量相对较低；第二，N-糖链由于缺乏疏水性基团以及缺少可带电的基团，因此在质谱中的离子化效率往往比蛋白质或肽段低，不易被质谱鉴定；第三，N-糖链本身的微观不均一性导致糖链在质谱中的信号分散和减弱，更加难以被质谱高灵敏鉴定；第四，目前尽管已有亲水富集柱，石墨化碳柱等固相富集方法，但这些方法由于固相载体和N-糖链之间的相互作用较弱，存在选择性较差的问题。

鉴于此现状，本申请的发明人拟提供一种更加特异和更加便于固液分离的N-糖链的固相富集方法，该方法有利于实现N-糖链的高选择性富集和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质组学和糖组学的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效的实现N-糖链选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的方法。

本发明提供了一种利用氨基磷酸盐对N-糖链进行衍生，并采用Ti⁴⁺修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@Ti⁴⁺富集N-糖链并质谱分析的方法。本发明利用氨基磷酸盐的氨基和N-糖链还原端的醛基间的还原胺化反应将磷酸根引入到N-糖链中，再利用Fe₃O₄@Ti⁴⁺上的Ti⁴⁺和衍生后N-糖链中磷酸根之间的螯合作用，将N-糖链固定在磁性纳米材料上,而非糖链则被清洗除去,最后再利用氨水将N-糖链从材料上解离下来，从而实现N-糖链的选择性富集并质谱分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.对蛋白质样品进行去糖链酶PNGase F处理，将N-糖链从蛋白质上解离下来；

2.用氨基磷酸盐对其中的N-糖链进行衍生并用Ti⁴⁺修饰的磁性纳米材料进行富集；

3.将N-糖链从磁性纳米材料上洗脱下来送入质谱分析。

具体的，本发明的一种固相富集N-糖链并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基磷酸盐对N-糖链进行衍生后，、以磁性纳米材料Fe₃O₄@Ti⁴⁺为吸附剂，实现N-糖链的选择性富集，其包括步骤：

(1)对蛋白质样品进行去糖链酶PNGase F处理，将N-糖链从蛋白质上解离下来；

(2)对蛋白质样品进行碱性磷酸酶CIP处理，去除蛋白质样品中的磷酸根；

(3)用氨基磷酸盐对其中的N-糖链进行衍生；

(4)加入Fe₃O₄@Ti⁴⁺材料与样品溶液充分混合；

(5)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

(6)用缓冲液清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；

(7)用氨水重新混匀材料；

(8)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。

更具体的，本发明的方法中，采用Ti⁴⁺修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@Ti⁴⁺为吸附剂，利用材料上的Ti⁴⁺和经氨基磷酸盐衍生后的N-糖链上的磷酸根之间的反应，将N-糖链固定在磁性纳米材料上，经外加磁场作用使得磁性材料与溶液分离，最终实现N-糖链的富集和质谱分析；

本发明中，蛋白质样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL；