[发明专利]一种N‑糖链固相富集并质谱分析的方法

权利要求书

1.一种N-糖链固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基磷酸盐对N-糖链的还原端进行衍生，再采用Ti⁴⁺修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@Ti⁴⁺为吸附剂对衍生后的N-糖链进行吸附，实现N-糖链的选择性富集；其包括步骤：

(1)对蛋白质样品进行PNGase F去糖基化处理，使糖蛋白质上的糖链释放；

所述的蛋白质样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL，溶于10-50mM碳酸氢铵缓冲液中，其中，蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的PNGase F酶；

(2)加入碱性磷酸酶，去除蛋白质样品中磷酸化蛋白质上的磷酸根；

所述的蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的碱性磷酸酶；

(3)冻干去除溶液后，再加入氨基磷酸盐溶液对糖链的还原末端进行衍生，

所加入的氨基磷酸盐终浓度为0.5-2.5mg/mL；反应溶液为甲醇，反应时间为1-3小时，反应温度为60-90摄氏度；

(4)冻干去除溶液后，再加入Fe₃O₄@Ti⁴⁺纳米材料及富集溶液，混匀，其中，

加入的Fe₃O₄@Ti⁴⁺材料浓度为1mg/mL-10mg/mL；Fe₃O₄@Ti⁴⁺磁性纳米材料进行样品富集的温度是25-37摄氏度，样品富集的时间是0.5-2小时，溶液为50％乙腈水溶液，其中含1-5％的三氟乙酸TFA；

(5)外加磁场，使磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

(6)用50μL－1mL 50％乙腈水溶液，其中含1-5％的三氟乙酸，清洗材料1-3次，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；

(7)加入氨水溶液，用5-10μL的5％NH₃·H₂O溶液混匀材料，将糖链从材料上解离；

(8)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。