[发明专利]用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法

权利要求书

1.一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米 纤维多功能补片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)；

(2)通过层层自组装技术(LBL)将带正电的壳聚糖(CS)和带负电的丝 素蛋白(SF)逐层交替组装到步骤(1)得到的纤维素纳米纤维底板表面，组 装5.5-15.5层，形成壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜；

(3)在步骤(2)得到的复合纳米纤维膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP) 和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞 (iPS-CM)种子细胞；通过三维共培养，制得所述用于促进心肌组织再生和干细 胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，静电纺丝技术制备纤维素 纳米纤维底板(Mat)包括以下具体步骤：

将醋酸纤维素以15-18％的质量浓度溶解至质量比为2:1的丙酮和二甲基乙 酰胺(DMAc)混合溶液中，采用常规静电纺丝装置，将混合溶液吸入带金属针 头的塑料注射器进行静电纺丝，其中，静电纺丝的控制电压为15-18千伏，接 收距离为18-20cm,滚筒以不高于100米/分的线速度转动，环境温度为 22-30℃，相对湿度35-45％，静电纺丝时间为8到16小时；将制备的纤维素纳 米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥，以去除溶剂，再将干燥后的所述底 板置于氢氧化钠溶液中水解，室温晾干。

3.如权利要求2所述的制备方法，特征在于，其中金属针头的内径为1㎜； 注射器由注射泵以0.5ml/h的速度驱动，制备的纤维素纳米纤维底板，置于真空 中室温条件下干燥时间至少为24小时，干燥后的所述底板置于0.05mol/L氢氧 化钠溶液中水解至少七天。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，壳聚糖-丝素蛋白复合 纳米纤维膜的形成包括下列具体步骤：

将带正电荷的壳聚糖以质量浓度为1％至2％的乙酸溶液为溶剂，配成1 ㎎/L的溶液，PH值调定至5.0，带负电荷的丝素蛋白配成1㎎/L的水溶液，PH 调定至5.3，将纤维素纳米纤维底板浸入带正电的壳聚糖溶液至少20分钟，用 0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次，每次2分钟；然后将纤维素纳米纤维底板浸 入带负电的丝素蛋白溶液至少20分钟，0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次,每次2 分钟，重复5.5-15.5次，得到覆盖5-15层壳聚糖-丝素蛋白双分子层，最外层覆 盖一层壳聚糖的所述复合纳米纤维膜。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括将制备好的 复合纳米纤维膜用剂量为3kGy的⁶⁰Coγ射线辐照3小时作灭菌处理。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在复合纳米纤维膜表面种 植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞 (AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CM)种子细胞,进行三维共培养，包括：

将辐照灭菌后的壳聚糖-丝素蛋白纳米纤维膜制成所需的形状和大小，将种 子细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CM)消化、重悬，制成 单细胞悬液，以20000-200000/cm²的细胞浓度的种植密度种植到材料表面，将 其置于37℃、100％湿度、5％CO2孵箱，用细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC) 培养液或心脏祖细胞(miPS-CM)分化培养液共培养24-96小时，可获得用于促 进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括种子细胞脂 肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养及心脏祖细胞(iPS-CM)的筛选培养：

(1)脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养包括：取6-8周稳定表达GFP 和Flu的雄性FVB小鼠精囊腺、双肾周围脂肪组织，用0.2％Ⅰ型胶原酶，37℃ 水浴消化1h，直至无肉眼可见组织块，用完全培养液(DMEM/F12培养基含 15％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素)置于37℃、100％湿度、 5％CO₂孵箱中培养，当细胞长满60％-80％培养瓶时，用0.25％胰酶(含 0.01％EDTA)消化传代，选用第二代至第五代AD-MSC作为种子细胞备用；

(2)心脏祖细胞(iPS-CM)细胞的筛选培养包括:取孕12.5天-14.5天的 C57孕鼠进行小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代分离培养以及饲养层的制备， 参照Yamanaka诱导培养小鼠诱导性多功能干细胞(miPS)的方法，每日换液、 每2至3天按1∶8的比例进行单细胞传代培养，将培养3天的鼠源诱导性多 功能干细胞(miPSCs)用0.025％的胰酶消化成单细胞，差速贴壁30min以去除 绝大部分饲养层细胞，1小时后，取上清细胞悬液，计数、离心后，使用分化 培养基(无Lif，余同miPS培养基)按照每滴20μl，500个/ml的密度将miPS 悬液滴加到10cm培养皿盖的内面，皿底加15ml PBS，将皿盖翻转并盖好，进 行悬浮培养，肉眼可见悬滴内有白色小颗粒，即为拟坯体(EB)，将拟坯体 (EB)移入低黏附培养皿中进行悬浮培养，3天后，将拟坯体(EB)转移至预 先铺有0.1％明胶的培养板中继续贴壁培养，在贴壁培养后第2天，即诱导后第 6天，使用Accutase酶将拟坯体(EB)消化至单细胞，用荧光标记的flk-1单克隆 抗体，无菌条件下进行流式分选，将flk-1阳性细胞，即心脏祖细胞(iPS-CM)使 用无菌血清收集后使用分化培养基继续贴壁培养。