[发明专利]一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）及其编码基因和应用。这对TALENs由特异性识别小鼠PPARγ2基因上特异序列的转录激活子样效应因子（TALEs）与Fok1蛋白融合形成，这对TALENs同时转入小鼠细胞系，能够对宿主细胞的PPARγ2基因进行特异性打靶，其打靶准确度高，打靶效率高。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用。

背景技术

PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)分子包括α、β和γ三型，分布在各不同组织，其功能涵盖范围之广是现今已知的其它生物医药分子所难以比拟的，具体包括糖尿病、肥胖和高血压等代谢症候群，而这些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问题。

PPARγ2主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(troglitazone,TZDs)作用的靶分子，成为近年来的研究热点。

选取哺乳动物小鼠3T3-L1细胞系(小鼠前脂肪细胞)的PPARγ2基因进行目标位点打靶，有着其特殊性。首先，PPARγ2基因与人类肥胖、免疫疾病等密切相关；其次，3T3-L1细胞在一定条件的诱导下，能分化成成熟脂肪细胞，即在分化后的细胞里能检出脂肪粒。这样，可以无动物实验的条件下观察PPARγ2基因的修饰效果。较少的花费就能进行对人们关心的肥胖问题进行较为简单有效的研究，对人类解决这类问题有极大的参考价值。

一直以来，生物学家在不断探索对目的基因进行定向改造和修饰。早期使用同源重组方法，但其效率较低，通常只有10^-6～10^-8，该方法主要在小鼠中应用，而无法在其它哺乳动物等模式动物中得到广泛推广。

近些年来发展很快的锌指核酸酶(ZFN)应用于精确基因组修饰的方法得到了很大发展。ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶(Fok1)构成。DNA识别域一般由3～4个Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成。每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。两个ZFN分别用锌指结构域识别5’-3’方向和3’-5’方向的DNA链，两个Fok1核酸酶的催化活性功能域可以切割靶位点，激活DNA自我修复机制，达到删除该段的目的，另一方面，切割靶位点制造出双链断裂后，细胞的修复机制被激活，DNA的同源重组机制会将外源的同源片段复制到断裂缺口上，从而达到引入外源基因片段的目的。虽然该方法使基因靶向修饰技术大大提高，但却存在靶向不确定、相对低效和脱靶问题。研究者很难根据目的基因序列设计特异且高效的ZFN，而商品化的ZFN价格极昂贵，因此，在一定程度上制约着该技术的广泛应用。

近年来，另一种基因改造新技术——CRISPR-Cas系统也正在迅猛发展，Cong、Mali和Cho这三个课题组开展的多项研究都表明这种RNA介导的Cas9系统在人类细胞当中同样能够正常发挥作用。研究发现，对化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的大约20bp长的双RNA复合体或者sgRNA，就可以对人体基因组进行定点切割和改造。但是这种技术仍然存在严重的脱靶的问题。