[发明专利]一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针及其检测蛋白质的方法。

背景技术

脱氧核酶(DNA酶)属于人工核酸的一种，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。例如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA一对发夹序列，实质是杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子时，两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的自由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致两个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量自由的G-四链体序列即可与氯化血红素(hemin)结合，催化氧化H₂O₂介导的ABTS，从而检测靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在以下问题：

(1)背景噪声较大、灵敏度较差。具体而言，在反应体系中，发夹结构与未形成发夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合的环而被保护，导致G-四链体序列并不全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个发夹杂交形成的，也有部分是直链的序列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链体序列的，因此无法实现较为灵敏的检测。

(2)利用碱基的杂交配位进行靶分子的检测，实际上仅能实现DNA的检测，而无法实现蛋白质的检测。

在疾病的早期诊断或某种病理状态下，蛋白质(特别是那些与癌症相关的蛋白质)作为生命的分子机器，是非常重要的。目前，通过检测蛋白质对疾病进行诊断的方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用的方法。但是，基于抗体进行测定的ELISA法通常耗时较长，并包含多个清洗步骤、操作繁琐。此外，还存在灵敏度不足、动态范围有限等缺陷。作为基于抗体测定法的替代，基于适配体测定法受到了极大的关注。适配体，是通过体外选择过程从随机序列的核酸库中被挑选出来的单链的DNA或RNA。它们对于小分子、蛋白质或其他目标具有很高的亲和性以及很好的选择性。与抗体相比，适配体具有明显的优势，如：更好的长期储存稳定性，可通过化学合成、实现大量快速的制备，可灵活的修饰各种官能团等。目前，已发展出多种基于适配体扩增的蛋白质检测分析方法，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链式反应(LCR)。虽然这些方法可以很好的提高蛋白质检测的灵敏度，但是通常需要对适配体进行荧光素和淬灭剂的化学修饰，或是使用核酸外切酶、核酸内切酶、纳米颗粒等，使得制备成本大大增加，且加大了制备难度。因此，免标记的、低成本的、简单易行的蛋白质检测方法仍然是未来的研发热点。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中对蛋白质的检测方法耗时长、成本高、检测探针的制备复杂，进而提供一种检测操作简单、低成本、免标记的检测蛋白质的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针灵敏度低、背景噪声大，进而提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法。

本发明的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针，包括一对邻位探针第一探针与第二探针、以及第一发夹与第二发夹；

所述第一探针包括：可特异性识别蛋白质的第一适配体区、可使所述第一探针与第二探针形成双链体的第一碱基互补区以及可与所述第一发夹部分杂交的第一DNA酶扩增区；