[发明专利]一种皮肤模型低温保存的固体培养基及其保存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种皮肤模型低温保存运输的固体培养基及其保存方法。

背景技术

随着体外替代科学的飞速发展，皮肤模型作为皮肤安全性测试的替代品，已被广泛的用于药品、化妆品等方面的测试。欧洲替代法委员会(ECVAM)已通过EpiDerm、EpiSkin两种皮肤模型产品的验证和相应的测试法案。

由于皮肤模型自身性能的特点，要求能够在体外保持其结构和活性，从而确保测试结果的准确性，因此模型的推广应用范围受到其保存运输条件的制约，同时还应最大限度地排除外来化学物的影响。因此开发一种适合组织工程皮肤模型保存运输的培养基意义重大。

目前常见的保存方法有低温保存和常温保存两种，低温保存又可以分为低温冷藏保存(4℃～8℃)和低温冷冻保存(-80℃和-196℃)，由于低温冷冻过程中易产生冰晶，而对细胞、组织造成损伤，若采用低温冷冻保护剂，因保护剂浓度过高会给模型带来毒性作用，影响产品应用效果；因此，组织工程皮肤模型常用的保存温度是4℃～8℃，保存时限为24h～72h。

然而，在4℃～8℃的低温条件下，尤其是在一个相对缺氧的无菌保存条件下，由于能量供给系统平衡被打破，导致皮肤模型中的细胞内外离子泵功能受阻，引起细胞内外Na⁺/K⁺比及Ca²⁺浓度失衡，细胞内部依赖该类离子的酶及生化反应过程受到影响，导致细胞生理活动受阻，细胞膜及细胞骨架损伤，表现为细胞肿胀、坏死或凋亡；另外，随着保存时间的加长，细胞也由有氧代谢途径转为无氧代谢途径，从而会产生大量的自由基和酸，自由基会选择性攻击细胞膜系统，加剧细胞低温损伤，最终造成皮肤模型失去活性。

针对上述问题，相继出现了许多组织低温保存液，如UW液(威斯康星大学研制的低温保存液，HTS-BASE(HYPOTHERMOL)，HTS-FRS，L-15液，DMEM等。但这些保存液主要用于保存离体器官，并且应用此类保存液要求将组织器官完全浸没其中，并需要一定的设备辅助完成保存。而皮肤模型主要用于化妆品药品中化学物质成分的安全性检测，在其表面不能接触任何可能会影响测试结果的化学物质，因此上述保存方法不适用。

中国专利200910078302.X中提到在基础培养液中加入营养物质和琼脂，制成固体培养基，用来保存组织工程皮肤，但该培养基仅限于常温保存，因地域、季节等多种因素，要维持常温保存条件需要特殊的温控设备，从而大幅度增加运输成本；若将该培养基用于低温保存运输，在长期低温缺氧状态下，细胞能量利用途径发生改变，由原来的有氧呼吸转为糖酵解，能量利用率大幅度降低，需要及时补充糖酵解所需代谢底物。同时需要补充能够提高各种生物酶活性的物质，对于糖酵解产生的大量的酸和自由基也应有抗氧化剂予以清除，而该培养基从成分上看仅包含能维持组织工程皮肤正常生理活动的物质，不具备能满足能量代谢转换，抑制代谢产物等损伤的成分，因而不具备有效减低低温缺氧损伤的作用，后果是细胞因为缺氧损伤及氧化损伤得不到抑制而导致整个组织活力下降，组织结构破坏，无法进行后续操作。

随着人们对低温损伤的不断研究，发现了很多可用于调节细胞离子转运、稳定细胞膜系统及细胞骨架，清除自由基，提高细胞能量代谢率等作用的化学物质，这些物质可发挥保护细胞、组织免受低温损伤的作用，据文献报道，海藻糖和蔗糖主要对维持细胞内外液体渗透压有重要作用；葡萄糖、腺苷及1，6-二磷酸果糖可以维持组织在有氧代谢及无氧代谢条件下的能量供应，保证细胞正常生理活动需要；去铁胺(DFO)可有效的降低细胞在低温保存复苏后凋亡及坏死比例，同时对于修复线粒体损伤，维持细胞骨架结构有很好的作用，加上甘氨酸、丙氨酸的对受损细胞的修复作用，可以有效的减少细胞及组织在低温缺氧状态下的损伤。α-生育酚(VE)属于抗氧化剂。而VC和VE协同作用可以更有效的发挥VE的抗氧化作用，降低自由基对细胞的损伤作用。

至今尚没有一种较理想的皮肤模型的低温保存运输培养基，该培养基应具有减少组织细胞低温缺氧损伤，有效保证皮肤模型测试结果的准确性，同时方便操作及长途运输的特点。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是针对组织工程皮肤在低温保存运输过程中存在的活力降低、结构损伤等问题，提供一种固体的低温保存运输培养基及使用方法。

本发明主要是通过以下技术方案来实现：

该组织工程皮肤低温保存运输固体培养基，其特征在于，其组分包括：细胞培养液及其添加成分。