[发明专利]一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种反向斑点杂交方法，特别涉及一种高灵敏度反向斑点杂交方法。

背景技术

斑点杂交方法首先由Kafato等发展起来，用于在固相支持物上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，该方法还可以进一步确定待测样品中靶序列的量。应用斑点杂交方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。多年来，斑点杂交并未受到研究者的青睐，原因之一在于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定。此外，正向杂交须先将PCR扩增产物固定，再与探针进行杂交，这样就要对每个标本的扩增产物进行固定，增加了操作步骤。

反向斑点杂交则是由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的固相支持物与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以固相支持物上固定探针取代固定靶核酸的方式，改变了传统斑点杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、重复性好以及信号稳定的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。

现有的反向斑点杂交技术都是以硝酸纤维素膜或尼龙膜作为固相支持物，不仅易于破碎，涉及的反应溶液和反应步骤众多，效率较低，而且检测待测样品中靶序列的灵敏度不高，分辨能力较差，容易出现假阳性和假阴性，难以满足医院临床检测的需求。

出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种特异性高、耗时短、易操作的高灵敏度反向斑点杂交方法及其在检测K-ras基因突变中的应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种反向斑点杂交方法。该方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。

本发明的又一目的在于提供所述方法在检测K-ras基因突变中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：

A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；

B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；

C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；

D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；

E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。

本发明的方法在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现了碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统反向斑点杂交方法中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交方法操作的耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。

根据本发明的一个具体实施例，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

金属是一种具有光泽的物质，其对可见光强烈反射。由于碱性磷酸酶催化底物可产生化学显色反应，能够在金属膜表面产生颜色变化，从而可以通过肉眼直观、快速地观察金属膜表面核酸杂交反应前后斑点颜色的深浅，以准确判断样品中含有的靶核酸情况。作为本发明的一个优选实施例，所述的金属膜优选银膜或铝膜。纳米级的银膜或铝膜能够呈现较好的反光性能，可以明显提高显色反应后检测靶核酸的分辨能力。此外，金属膜还结实耐用，易于清洗，容易去除杂交背景。

根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片或塑料片，优选塑料片，更优选环烯烃共聚物塑料片。