[发明专利]一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用

权利要求书

1.一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：

A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；

B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；

C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核 酸进行一步反应；

D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；

E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜， 优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述预处理液包括胱胺、 脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉的脂肪醇聚氧乙烯醚， 所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为 3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺 为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述碱性磷酸酶 标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述杂交液包括 锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通， 所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为 0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子 型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为 0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的 0.05～0.2％(w/v)。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液包 括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0.5～5％ (w/v)，优选1～4％(w/v)。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液的 PH为9.0～10.0。

10.根据权利要求1～9中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述预处理是将 所述固相支持物浸泡在25～37℃温度的所述预处理液中30～60min。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述核酸探针选自长度为 15～40个碱基的寡核苷酸探针，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针。

12.根据权利要求1～11中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述反应的温 度为35～50℃，反应时间为5～30min；优选地，反应温度37～42℃，反应时间10～15min。

13.根据权利要求1～12中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C)之前还包括使 用用于扩增靶核酸的生物素标记的引物进行PCR反应而扩增靶核酸的步骤。

14.根据权利要求1～12中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C)之前还包括在 生物素标记脱氧核苷酸的存在下进行PCR反应而扩增靶核酸的步骤。