[发明专利]从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基，属于生物技术领域。

背景技术

乳房是母畜特有的哺育器官，泌乳期乳腺内充满丰富的腺泡和导管(崔立莉，2006)。乳腺是由外层肌上皮和内层分泌上皮细胞围成的球形结构，与导管相连，其中分泌上皮是腺泡内合成乳成分的基本单元，是其行使泌乳功能的基础。因此，它是研究乳成分合成和变动机制、乳腺发育和变化以及乳腺肿瘤形成、癌变的相关因子和基因的不可或缺的实验材料(杜鹃等，2007)。

目前，乳腺上皮细胞的培养历史已有100多年，作为一种高度分化的成体细胞，其在离体培养一段时间后往往出现形态和特性的脱分化，趋向变为成纤维样的状态(Ebner等，1961)。有限二倍体细胞由于脱离正常的体内环境，原代培养后逐渐脱分化的现象是很常见的。面对这种问题，研究人员用基因转移技术将SV40、原癌基因和人端粒酶逆转录酶基因等外源基因整合到有限细胞内，可获得永生性的转化细胞(陶谦等，2001)。永生性细胞在保持着部分与起源细胞相似的生物特性和表型的同时，也表现出一些转化和纯化培养后的新特点。外源基因随机整合到宿主细胞基因组的位置不确定，其插入位点可能影响到细胞原有基因的功能，克隆细胞由于缺少细胞互作的影响也表现出新的特征。已有的永生化乳腺上皮细胞系对因子刺激的反应和乳成分的表达存在差异，这些不确定性使其应用受到限制。

由于永生化细胞的诸多不确定性，原代细胞系更能代表体内的器官特异性功能和信号转导途径。一般体外培养的乳腺上皮细胞可以稳定培养几个月，能满足细胞实验周期的需要。因此，多数生物学实验还是首选原代培养的乳腺上皮细胞(Pantsckenko等，2000)。原代细胞经过多次传代后丢掉一些原始的受限制的特性，在生长率、乳汁合成、对因子刺激的反应和敏感性上与体内细胞存在差异。不过，这个问题可以通过低温贮存新鲜分离的细胞来解决，对培养细胞运用冷冻解冻技术(Bramley等，1982)，以保持其原有细胞特性，让符合研究需求的原代细胞和传代细胞能够得到长久保存，使在不同实验条件下分析同一原始特性细胞的特征成为可能。同时，可通过添加一些生物活性因子(胰岛素，氢化可的松，表皮生长因子，转铁蛋白等)促进细胞增殖和维持细胞特性，延缓细胞脱分化。

目前国内培养原代乳腺上皮细胞通常采用的方法为组织块培养法，这种方法通过活体穿刺或屠宰获得活体组织，一方面对牛体的损害较大、购买健康成体牛的成本高；另一方面，多获得的是淘汰牛的活体组织，难以获得高产牛的组织样品。

发明内容

本发明的目的是提供一种从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基。

本发明提供一种从牛乳汁中分离和培养乳腺上皮细胞的方法，包括如下步骤：选择牛乳汁中体细胞数低于5×10⁴个/ml并且处于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分离并培养牛乳汁中的乳腺上皮细胞；

所述泌乳中后期为产犊后150-250d；

所述采集牛乳汁时前50-100ml牛乳汁不收集。

上述方法中，所述分离并培养牛乳汁中的乳腺上皮细胞包括分离并培养原代牛乳腺上皮细胞，再将原代牛乳腺上皮细胞进行传代培养，得到传代的牛乳腺上皮细胞。

上述任一所述的方法中，所述原代牛乳腺上皮细胞和传代的牛乳腺上皮细胞培养时使用的培养基按照如下方法制备：将DMEM/DF12培养基和FBS按照体积比为9：1混匀，加入终浓度为1×的青霉素，终浓度为1×的链霉素，终浓度为5ug/mL的胰岛素，终浓度为5ug/mL的转铁蛋白，终浓度为5ug/mL的氢化可的松，终浓度为10ng/mL的表皮生长因子，终浓度为1ug/mL的孕酮，终浓度为10ng/mL的重组牛胎盘催乳素；

所述DMEM/DF12培养基购自Gibco，产品目录号为C11330500BT；

所述终浓度为1×的青霉素和终浓度为1×的链霉素的母液是浓度为100×的青霉素/链霉素双抗溶液；

所述浓度为100×的青霉素/链霉素双抗溶液的商品名称为青霉素/链霉素双抗溶液(100×)，购自Gibco，产品目录号为15140-122；

所述重组牛胎盘催乳素购自Prospec，产品目录号为CYT-511。

上述任一所述的方法中，所述牛为奶牛。

上述任一所述的方法中，所述奶牛为荷斯坦牛。