[发明专利]小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体及其构建方法，属于疾病的基因治疗领域。

背景技术

   维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptor, RORα, NRIFI)，属类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子，可直接进入细胞核调节靶基因的转录，从而参与多种重要生理过程的调节，在形态发育、细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥重要作用。研究发现，RORα基因缺陷的模型小鼠，体内出现了广泛而严重的功能性障碍，尤其是容易发生自身免疫性疾病和过敏性疾病，或表现出明显的免疫功能异常，如T和B细胞功能缺陷、巨噬细胞释放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-a)等。RORα与免疫系统的密切关系还在多种动物模型的研究中得以证实，并被视为化学治疗的潜在靶点。

    基因治疗的常用载体包括病毒载体和非病毒载体，非病毒载体转染效率低、体内表达不稳定，包括脂质体、多聚阳离子聚合物、纳米粒、胶束、细菌质粒等；病毒载体不仅有较高的基因转染效率，而且有实现外源基因稳定表达的优势，故是目前基因治疗中应用最广泛的载体类型。但因病毒载体有激活体内原癌基因的可能性而存在安全隐患。逆转录病毒做为载体用于治疗，也有引起死亡和诱发发白血病的报道，因此逐渐被淘汰。腺病毒载体表达外源基因时间短，免疫原性强，可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫应答，不适于慢性免疫紊乱性疾病的治疗。

发明内容

   针对上述问题，本发明提供一种二型腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV2)载体，基因组小，含4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组，可感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱，是目前较为理想的基因治疗载体。

  本发明解决其上述问题所采用的技术方案如下：

1. 小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体的构建方法，按照以下步骤进行：

 （1）克隆小鼠RORα基因（参考NCBI中提供的序列：NM_013646.2），应用PCR技术于小鼠的脑组织扩增出RORα mRNA的CDS区，共1572bp，于CDS区的上下游分别引入EcorI和XbaI酶切位点，将琼脂糖凝胶电泳并胶回收后的RORα片段和pMD18T克隆载体(购自TARAKA)进行T-A克隆，转化大肠杆菌Stbl3（购于上海迈其生物科技有限公司）并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行AMP抗性筛选，挑取阳性菌于液体培养菌增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体记为pMD18-T-RORα克隆载体。

 （2）将pMD18-T-RORα以及PZAC2.1(核心质粒)(盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)进行EcorI和XbalI双酶切，再分别胶回收琼脂糖凝胶后的PZAC2.1的载体片段和RORα片段，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，同样转化stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行筛选，挑选阳性菌落，次日取菌液按照菌液与培养基比例为1:100接种于的肉汤增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体命名为pZAC2.1-RORα。

    2. AAV2-RORα（小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒）的包装，按照以下步骤进行：

（1）首先制备各种质粒：pZAC2.1-RORα、pAd-detaF6（辅助质粒）、p5E18（包装质粒）（其中pAd-deltaF6 和 p5E18为盘尼西亚大学赠送，本实验室保存）；

（2）复苏并传代HEK293细胞(购自ATCC)，采用磷酸钙共沉淀的方法将pZAC2.1-RORα、pAd-detaF6、p5E18按一定比例（1:2:1）共转染70%-80%汇合度的HEK293细胞。

（3）过夜更换新鲜完全培养液，48-72小时收获细胞，其间于荧光显微镜下检测转染的效率以及产毒的效果；收获细胞，加DMEN重悬已含病毒的HEK293细胞，-80和-37℃反复冻融三次，加入40微升的Benzonase(250U/微升)，37℃30min，去除非病毒核酸，以3000g常温离心，收集的上清即为病毒粗制液。

（4）加入10%DOC（脱氧胆酸），37℃孵育20min，先后经过5μm和0.8μm的滤膜滤去细胞碎片，收集过滤液。

    3. AAV2-RORα的纯化方法，按照以下步骤进行：