[发明专利]高通量STR序列核心重复数检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测方法。

背景技术

十九世纪八十年代发现的DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性(生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异)的多种多样的手段，如RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)分析、串联重复序列分析、RAPD(随机扩增多态性DNA)分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为当时最具吸引力的遗传标记。

1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。随着生物技术的发展，DNA聚合酶链式反应(PCR)技术的出现使对样品量的需求大大降低，将分析目标集中到VNTR(可变数目串联重复)中的较短的重复序列(STR)，使得较短的核酸片段也能够用于分析。后来进一步出现了多重PCR技术，使STR基因分型检测在法医和刑侦中迅速推广。

短串联重复序列又称简单重复序列(SSR)或微卫星DNA(microsatellite DNA)，由2～6bp的核心序列组成，重复次数通常在15～30次。STR广泛存在于真核生物基因组中。由于STR核心序列的重复次数存在个体间差异，具有高度多态性，因而被作为一种遗传标记广泛地应用于植物、动物的种类鉴定中。在人类基因组中，STR分散在人的整个基因组中，平均每15～20kb就存在一个STR基因座，约占人基因组的3％。STR标记还具有多态性丰富、易于检测等特点，因此被广泛应用于人类遗传制图、基因定位、连锁分析、亲子鉴定、罪犯鉴定和人类遗传研究等方面。

目前通用的STR检测方法主要采用上世纪九十年代提出的分组多重扩增STR基因座并通过荧光毛细管电泳对扩增片段长度进行检测，最后反馈出与核心重复数相应的荧光峰位。其基本原理是利用基因座内等位基因长度的不同以及扩增的基因座之间片段长度范围的不同，采用高分辨率的毛细管电泳技术进行分离。通常，对于每个基因座中一条引物进行荧光标记，不同的基因座引物标记不同的荧光，结合扩增片段的迁移率和荧光的颜色，应用基因序列分析仪及采用相应的分析软件可自动化检出复合扩增的众多STR基因座的所有信息。

根据上述的检测原理，不难判断，目前的STR检测方法具有如下的不足之处：(1)检测反应基于第一代测序技术类似的荧光毛细管电泳法，该法的通量很低，无法对海量样本进行大规模并行检测；(2)由于需要根据产物片段的长度对STR进行荧光分组，这意味着该方法对检测的基因座有数量上的限制，难以通过增加待测STR序列的手段，进一步提高生物学个体的识别率；(3)存在无效等位基因，致使不同的试剂盒有可能出现某些基因座测定结果的差异；(4)由于是对片段长度的检测，对STR内部核心重复中的单核苷酸多态性(SNP)位点无法检测出来。

发明内容

发明目的：提供一种高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测方法，以快速有效地以较低成本对海量样本的多个STR序列进行大规模地并行检测，解决现有技术存在的一个或多个问题。

技术方案：一种高通量STR序列核心重复数检测方法，包括以下步骤：

A.将一对引物杂交到待测STR序列上，其中下游引物带荧光标记；

B.重复交替地加入核苷酸单体组合，利用具有5’→3’外切酶活性的DNA聚合酶合成待测STR序列的互补链，每次加入核苷酸单体组合完成聚合反应后进行清洗，然后检测荧光强度；

C.分析荧光信号的变化及信号变化发生的轮次，判断STR序列的杂合情况并计算出核心重复数。

其具体操作过程包括以下步骤：

(1)样本基因座STR序列的特异性扩增

选取相应数量的STR序列，作为检测对象；通过多重PCR技术，将上述STR序列从人类DNA样本的相应基因座上扩增出来；

选取完待检STR序列后，根据STR序列中核心重复单元的序列信息来设计聚合时的核苷酸单体组合以及设计多组STR序列同时检测的分组检测方案，同时还需要设计每种STR序列相应的上下游检测引物并合成；

(2)检测基片上STR序列的固定及文库制备

检测基片上的每一个反应位点上仅有唯一样本的同一种STR单链序列拷贝；