[发明专利]重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人骨形态发生-2的方法，属于蛋白质生物化学工程领域。 

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)为Urist于1963年发现(Marshall R.Urist m R.Bone formation by autoinduction.Science,1965,150:893)，能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。BMP最初被认为是软骨和骨形成的蛋白质调节剂(Marshall R.Urist m.The substratum for bone morphogenesis.Dev Biol(Suppl),1971,4:125)，但他们随后表现出与各种组织和器官的胚胎发育和形态发生有关的性质。同时BMP也表现出调节各种细胞的生长、分化和趋药性的作用，包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经细胞。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。研究表明，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用(Riley e A,Lane J M,Urist M R,et al.Bone morphogenetic protein-2:Biology and application.Clinic Orthop,1996,324:39)。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。其主要过程是：增加或抑制这些细胞内的某些特异性蛋白的分泌，使成纤维细胞分化为成骨细胞，成肌细胞快速分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建(Kaffagiri t,Yamaguch A,et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblast into theosteoblast lineage.J-Cell-Biol,1994,127:1755；Kanatani t,Yamaguch A,Ikeda T,et al.The non-osteogenic mouse pluripotent cell line,c3H10Ti/2,is induce todifferentiate into osteoblastic cell by recombinant human bone morphogenetic protein-2.Biochem-Biophys-Res-Commun,1990,192(1):295；Long m W,Robinson J A,Ashcraft E A,et al.Regulation of human bone marrow-deriyedosteogenitor ceels by osteogenic growth factors.J Clin Invest,1995,95:881)。BMP-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠。成熟的BMP-2以二聚体形式才具有生物活性。 

目前，人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组BMP-2(rh BMP-2)，并且在常位和异位成功地诱导出新骨(胡蕴玉.骨诱导及BMP的研究现状与展望.中华骨科杂志，1996，34(10)：579)。BMP-2在临床中的应用展示广阔的前景(金岩，司晓辉，杨连甲等.骨形态形成蛋白在下颌骨骨折中的表达及mRNA水平分析.中华创伤，1996，12(6)：353)。本重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)单体含全部114个氨基酸残基，单体分子量12.9KD，它的同二聚体具有与天然骨形态发生蛋白-2相当的生物活性。