[发明专利]重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法

权利要求书

1.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法，其包括如下步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述漂洗包涵体和调节不同pH值步骤是用含有0.1-5％的去污剂的去离子水和调节不同的pH值至2-10，漂洗包涵体3-5次。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述去污剂为曲拉通X-100。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述包涵体蛋白控速复性步骤为：添加水或缓冲液降低尿素浓度来实施的。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速复性该包涵体蛋白步骤是通过控制添加水或缓冲液的流速为1-100mL/分钟来实现的。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速复性该包涵体蛋白步骤是通过控制添加水或缓冲液的流速为5-20mL/分钟来实现的。

7.如上述权利要求所述的方法，其中，所述超滤膜浓缩的步骤是用截留分子量为10000道尔顿-35000道尔顿的超滤膜进行反复超滤浓缩。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：

1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；

2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；

3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；

4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；

5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心

0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；

6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；

7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；

8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；

9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；

10)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；

11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；

12)用截留分子量为26000-35000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；

13)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。