[发明专利]系列广谱抗菌肽的制备、纯化、鉴定及其用途

说明书

技术领域

本发明为一种短短芽孢杆菌X23外泌新型非核糖体抗菌肽Edeine家族同系物及其发酵制备，属于生物医药领域，本发明涉及新型非核糖体抗菌肽的微生物发酵、纯化、鉴定及其应用。

背景技术

短短芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，菌体呈短杆状，细胞壁厚，广泛分布于自然界。该菌在生长过程中可以向外界分泌种类丰富、数量可观的蛋白质和非核糖体肽（non-ribosomalpeptide,NRPs）等次生代谢产物。

NRPs由非核糖体肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetases,NRPSs)催化合成。NRPSs是由多个酶按模块化(module)组成的大的复合体，每个酶含一个或多个模块，每个模块激活一个特定的氨基酸并将其整合到新生的肽链中(GrünewaldandMarahiel,2006)。典型的模块由腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)等三个核心结构域组成，模块的数量、排列顺序和方向与其产物的氨基酸数量、排列顺序和方向之间存在严格的共线性关系，如短杆菌酪肽(tyrocidine)等。此后还发现了另外2种合成NRPs的方式：iterativeNRPSs和nonlinearNRPSs。IterativeNRPSs是指同一个模块或结构域在肽链合成过程中不止一次地往新生肽链上重复激活和添加某个氨基酸，导致肽链由多个小的重复序列组成；NonlinearNRPSs方式合成的肽链顺序与其合成酶的模块之间并不存在严格的共线性关系(Mootzetal.,2002)。在NRPSs的最后一个模块的C-末端通常有起终止延伸和释放产物功能的硫酯(thioesterase,TE)结构域。除了上述核心结构域，在同一个模块内可能还存在一些附加的结构域，如差向异构结构域(E结构域)和甲基化结构域(M结构域)等，它们在肽链合成过程中对氨基酸底物进行修饰；乙酰化、糖基化和脂质化等结构域则对肽链骨架进行修饰。如果不具有这些结构域，修饰作用则由独立于NRPSs的酶催化完成(Schwarzeretal.,2003;GrünewaldandMarahiel,2006)。

NRPs在医药、农业和生物学等领域具有极大的研究价值和应用潜力，除了可以杀死或抑制病原菌，NRPs还被广泛用于抗肿瘤和抑制免疫反应等(CoppingandDuke,2007)。目前临床应用最多的10种抗生素类产品中有8种为NRPs(Saleemetal.,2010)，在抗感染和抗肿瘤等领域的市场份额分别达到了68.3%和79.8%(Craggetal.,2009)。NRPs也可以抑制或杀死作物病原微生物，在农业领域也具有良好的应用潜力。因此，NRPs的分离、鉴定和应用是当前天然产物研究的热点之一，预示该非核糖体抗菌肽在治疗和预防癌症和抗病毒方面具有良好的应用前景。

发明内容

本发明涉及非核糖体抗菌肽Edeine家族的制备、纯化、鉴定及其应用。

短短芽孢杆菌X23是一种能分泌对多种病原微生物具有抑制杀伤作用的非核糖体抗菌肽的根际微生物。这些非核糖体抗菌肽具有热稳定性高、耐受蛋白酶水解的能力强和不易诱导靶标微生物产生选择性抗性等特点。由于此类抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于其发酵液中，并且有环状结构和非编码氨基酸。

X23发酵液的制备

将冷冻保存的短短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB或LB培养基的三角瓶中，25℃--30℃过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液。将该种子液接种于新鲜的液体培养基，得到X23的发酵液；X23发酵液经高速离心后，取上清液经微孔滤膜过滤，彻底去除菌体，得到无菌发酵液，减少了后续处理中因残留菌体破裂、胞内蛋白质和小分子物质对非核糖体抗菌肽分离纯化的干扰。

X23非核糖体抗菌肽粗制备液

取上一步骤制备的X23无菌发酵液，浓缩后用等体积氯仿抽提，高速离心后收集上层水相；再经80℃水浴后高速离心，弃沉淀，上清液即为X23非核糖体抗菌肽的粗制备液。其有益效果是为了简化样品组成。

X23非核糖体抗菌肽的富集

为了进一步简化样品组成，并富集非核糖体抗菌肽，将粗制备液经弱阳离子交换树脂处理。其有益效果是样品被大大简化，同时也为工业化生产工艺的研发奠定了基础。

X23非核糖体抗菌肽的高效制备液相色谱分离

将非核糖体抗菌肽粗品进一步利用硅胶基质C8或C18作为反相固定相，采用高压制备液相色谱对目标峰进行制备，得到高纯度Edeine家族同系物。