[发明专利]系列广谱抗菌肽的制备、纯化、鉴定及其用途

权利要求书

1.一系列由短短芽孢杆菌X23菌株(BrevibacillusbrevisX23)合成并分泌的非核糖体抗菌肽，是非核糖体抗菌肽Edeine家族的同系物，其特征在于具有如下的氨基酸序列：(S)-Phe-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Gsper、(S)-Tyr-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Gsper、(S)-Phe-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Sper、(S)-Tyr-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Sper。

2.权利要求书1所述非核糖体抗菌肽Edeine家族的制备、纯化、鉴定方法，其特征在于，包括：

步骤一：将冷冻保存的短短芽孢杆菌X23菌种接种于装有培养基的三角瓶中，培养即得发酵培养的种子液，再将该种子液接种于新鲜的液体培养基，得到X23的发酵液；

步骤二：去除X23发酵液中菌体等固体杂质，得到无菌发酵液；

步骤三：将无菌发酵浓缩后经有机溶剂抽提，收集水相，高温处理后去除沉淀，得X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液；

步骤四：采用树脂富集粗制备液中的非核糖体抗菌肽，吸附后洗脱去除非活性组分，得到非核糖体抗菌肽粗品；

步骤五：采用高效制备液相色谱对步骤四所述粗品进一步纯化；

将粗品溶解后，采用疏水反相分离材料为固定相，有机溶剂和水为流动相，收集活性肽洗脱液，进一步将非核糖体抗菌肽的纯度提高到>95%；

步骤六：采用高分辨质谱测定精确分子量，并结合核磁共振数据，确认系列非核糖体抗菌肽为Edeine家族同系物EdeineA、EdeineB、EdeineD、EdeineF。

3.根据权利要求书1中步骤一所述，其特征在于采用PDA、NB、NA或LB作为培养基，20℃--35℃，100-350rpm培养过夜，将该种子液以体积比5%-20%接种于新鲜的NB液体培养基，培养24h-48h，得X23发酵液；更优选的条件是采用NB或LB作为培养基，25℃--30℃，180-250rpm培养过夜，将该种子液以体积比8%-15%接种于新鲜的NB液体培养基，培养30h-40h。

4.根据权利要求书1中步骤二所述，其特征在于采用高速离心或微滤膜过滤等方式去除固体杂质。

5.根据权利要求书1中步骤三所述，其特征在于所述有机溶剂为石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种，更优选的是氯仿。

6.根据权利要求书1中步骤四所述，其特征在于所选用的树脂为阳离子交换树脂，包括强阳离子交换树脂和弱阳离子交换树脂，更优选的为弱阳离子交换树脂；洗脱方法为本领域技术人员所熟知的方法。

7.根据权利要求书1中步骤五所述，其特征在于高效液相制备色谱所采用的分离材料为反相材料，包括聚合物基质反相材料和硅胶基质反相材料，更优选硅胶基质键合辛烷基或十八烷基的反相材料；洗脱方法为本领域技术人员所熟知的方法。

8.权利要求书1所述非核糖体抗菌肽，其特征在于，包括但不限于对真菌和细菌有杀灭作用，包括烟草青枯病菌、大肠杆菌、大白菜软腐病菌、水稻白叶枯病菌和金黄色葡萄球菌、马铃薯晚疫病菌、烟草黑胫病菌和水稻稻瘟病菌等。