[发明专利]一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株，在真核菌株的基因组中整合表达3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因、表达FPP合酶的基因、和表达青蒿二烯合酶的基因；该整合为整合在真核菌株的基因组的多拷贝位点。本发明提供的产青蒿二烯的重组真核菌株属于整合型重组菌株，该重组菌株显著提高了青蒿二烯的产量，更有利于青蒿二烯的生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种产青蒿二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备青蒿二烯的方法。

背景技术

天然化合物主要从以下几个途径得到：(1)从植物中提取；(2)利用化学合成的方法合成；(3)利用合成生物学手段合成。合成生物学是生产大规模且性能稳定的天然化合物的新学科，为直接从植物中提取和化学全合成的一个重要替代方式，这种方式主要是通过基因工程手段将天然化合物合成途径的相关酶基因导入到酵母、大肠杆菌或者植物等一些常用的模式底盘细胞中，在底盘细胞中重新构建可以生产天然化合物的途径，进而表达天然化合物。

青蒿素及其相关衍生物已被世界卫生组织认定为目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿二烯(Amorphadiene)是青蒿素的重要前体化合物之一，其分子式为C₁₅H₂₄，是典型的倍半萜类化合物。青蒿二烯经过开环过氧化，可形成倍半萜类过氧化内酯化合物青蒿素。合成生物学手段是获得青蒿二烯的重要途径之一。

研究发现，青蒿植物中青蒿二烯的积累分两个步骤：(1)生成法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)；(2)青蒿二烯合成酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)催化FPP经过两步环化反应形成青蒿素的中间体紫穗槐-4,11-二烯。其中，FPP作为倍萜类化合物的共同前体，它的合成主要通过两条独立的生物途径：存在于真核生物、古生菌和一些原核生物内的甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径以及细菌和光合真核生物的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径。所以，这两个途径，以及途径中关键的酶是利用合成生物学技术合成青蒿二烯的关键。

目前，用于青蒿二烯合成生物学研究的底盘细胞主要有大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、植物细胞和其他微生物。其中，应用最广泛的是大肠杆菌和酿酒酵母。大肠杆菌中存在唯一的萜类合成途径MEP途径，而且已经有研究表明，MEP途径在萜类合成方面具有更大的潜力，适合合成萜类化合物碳骨架，大肠杆菌是较早被广泛应用于青蒿素半合成的微生物底盘细胞。2003年，Keasling课题组将重构的MVA途径导入E.coli体内，得到可以生产青蒿二烯的人工细胞。随后，Keasling课题组又经过一系列底盘改造和发酵优化，最终得到青蒿二烯产量为27.4g/L的人工大肠杆菌细胞。2014年，汪建峰等通过引入外源MEP途径基因改造大肠杆菌底盘细胞，同时优化发酵过程，得到可以生产青蒿二烯6.1g/L的人工大肠杆菌细胞。但是由于大肠杆菌体系缺少糖基化和翻译后修饰等功能，不利于青蒿二烯后续生产中的修饰，限定了其应用。

所以，更多研究者选择生长繁殖速度快，基因操作简单，可以进行大规模发酵生产的酵母作为研究底盘。根据重组菌株的构建方式，在利用酵母作为合成生物学中的底盘细胞时，将外源基因导入底盘细胞后得到两种重组工程菌：附加体型重组菌株和整合体型重组菌株。针对表达青蒿二烯的重组菌株，2009年孔建强等在药学学报《酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究》中报道了附加体型酵母工程菌产青蒿二烯的产量要高于整合体型酵母工程菌。

发明内容