[发明专利]一种PCR检测蝗虫微孢子虫病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种采用PCR诊断技术检测蝗虫微孢子虫病的PCR检测技术。

背景技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术具有特异性好、敏感性高、产率高、重复性好、快速、简便、易自动化等多种优势；该技术能在一个试管内将目的基因或某一DNA片段于很短的时间内扩增至十万乃至百万倍，结果甚至能够通过肉眼直接观察和判断；借助该技术，技术人员可以从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天甚至几个星期才能做到的事情，采用PCR分析技术在几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑意义上的检测技术，其从分子生物学水平给检测领域带来突飞猛进的发展。

微孢子虫，是一种由孢子形成的单细胞寄生虫，它属于真菌界(Fungi)、微孢子虫门(Microsporidia)。目前有多于一百万种微孢子虫。微孢子虫可寄生大部分动物，多数感染昆虫，是昆虫常见的病原微生物。

目前PCR分子检测技术已经越来越多地应用于各个领域的研究，PCR分子检测技术在检测家蚕的微孢子虫等病原微生物的方法中得到应用，但还没有采用PCR诊断技术检测蝗虫微孢子虫病的相关报道。蝗虫微孢子虫是具有良好持续治蝗效果的病原物。当前，对于蝗虫微孢子虫病的诊断，主要采用镜检法。但由于蝗虫微孢子虫个体微小，常规镜检存在观察形态差异不明显，并且该法耗时耗力且灵敏度较低，还没有相关的分子生物学的快速检测方法。因此，如何能够快速、准确、灵敏检测蝗虫微孢子虫病，已成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种根据蝗虫微孢子虫极管蛋白基因序列设计引物，扩增蝗虫微孢子虫特异基因片段，建立蝗虫微孢子虫的分子鉴定体系，最终实现蝗虫微孢子虫病的快速、准确、灵敏检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测蝗虫微孢子虫病的PCR引物，所述引物包括：

上游引物Nlos-F5：5’-GCTCC AAATA CAGCG TAAAT GC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物Nlos-R5：5’-GAGAT TCGCA TTCGC CACAG C-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供包含上述引物的用于检测蝗虫微孢子虫病的试剂盒。

所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种PCR检测蝗虫微孢子虫病的方法，其是利用上述引物或试剂盒对蝗虫微孢子虫进行PCR检测。

所述方法包括以下步骤：

1)提取样品组织中的总DNA；

2)以步骤1)中的总DNA为模板，Nlos-F5和Nlos-R5为引物，进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

所述方法的PCR反应体系以25μl计为：

2×Taq Master Mix，12.5μl；10μM引物Nlos-F5，1μl；10μM引物Nlos-R5，1μl；DNA模板，1μl；ddH₂O，9.5μl；总反应体系为25μl。

PCR反应条件为：95℃，5min，1个循环；94℃，30s，66℃，30s，72℃，30s，35个循环；最后72℃延伸10min，1个循环。

本发明的有益效果：

1.可以大批量快速鉴定蝗虫感染蝗虫微孢子虫情况。

2.检测所需样品量大大减少，同时检测精准度大大提高。且结果可信度高，灵敏度可以达到7×10³孢子/ml。

3.与传统镜检法相比，大大降低检测成本和工作量。

附图说明

图1为蝗虫微孢子虫的PCR检测结果图，其中：M：200bp DNA Ladder Marker(Tiangen)；1：未染病蝗虫DNA PCR产物；2：蝗虫微孢子虫DNA PCR产物。