[发明专利]一种多肽提取与分离方法

说明书

技术领域

本发明属于一种分离技术和生物分析与检测领域，具体涉及一类能高效提取水中某些多肽，又能高效脱附的多肽提取与分离方法。 

背景技术

多肽的提取与分离是当今的一项重要技术。比如某些多肽有特定的生理功能，但在原料中含量很低，这时就需要进行提取浓缩。再比如在蛋白、核酸分析中，基质辅助激光解析离子化飞行谱(MALDI-TOF)是一种极为灵敏的质量检测技术，适合大分子质量的检测，灵敏度非常高，特别适合多肽、蛋白等检测，但是在体系中丰度较低的多肽却很难被检测到。这种情况下就可采用提取洗脱技术进行检测。这对于构建蛋白和核酸序列是十分必要的。科学界针对多肽的分离和检测已开发了多种技术，例如双向电泳，各种色谱技术等。这些技术针对微量操作效果是理想的，在检测上也有重要意义，主要是确定化学物种的存在，但一般不能直接提供分子量等信息。其它技术如等电点沉降对痕量物种效果不理想。近年来，提取特定多肽的技术有重大突破。例如以结构明确的磁性纳米颗粒吸附特定多肽，再进行洗脱浓缩和分析。这些技术对于磷蛋白、糖蛋白等翻译后改性蛋白的分析是非常有用的。但这些材料的合成要求很高，一般针对特定多肽有效。总体而言，还缺乏一种通用而高效的多肽提取剂。 

另一方面，多肽的脱附是一个重要的技术挑战。一般而言，多肽分子量较大，与吸附剂间作用点多，与吸附剂的作用很强。正如有文献指出的那样，缔合常数与作用点成指数增长关系。而多肽不同于小分子，作用点很多，故强吸附通常容易发生，但解吸很难。因此在多肽的提取分离中，难解吸是重要技术挑战之一。应该注意到，多肽尽管可以带一定电荷并且可以是水溶性的，但本质上都有一定亲油性，这种亲油作用是导致其难以从吸附剂上解吸下来的重要原因之一。一般而言，常规吸附剂都具有选择性偏低，解吸率低的特点。本发明的目的是提供一种能高效、高选择地吸附某一等电点的多肽同时又能高效地解吸的吸附剂。利用对吸附剂的设计或选择，可最大化pH-可逆的离子作用而最小化亲油互补作用，就能实现高效吸附和高效解吸。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽提取与分离方法，该法并能有效提取等电点在特定范围的多肽，并通过分离洗脱来达到纯化目的。 

本发明提出的多肽提取与分离方法，具体步骤如下： 

(1)  对单一多肽的吸附与释放

(1.1)配置浓度为1×10^-2摩尔/升~1×10^-8摩尔/升的多肽的缓冲水溶液，控制缓冲水溶液pH值大于多肽的等电点pI，然后向所得溶液中加入吸附剂SiO₂@PEI，并进行紫外/可见光谱的时间检测，随着时间加长，吸光度越来越低，直到吸光度不发生变化，即认为达到了吸附平衡；

(1.2)将上述吸附了多肽的吸附剂SiO₂@PEI过滤，并采用新鲜的缓冲水溶液洗涤，所述缓冲水溶液与步骤(1.1)所述的缓冲水溶液的pH值相同，然后该吸附剂SiO₂@PEI所吸附的多肽用另一缓冲水溶液洗脱回收，所述另一缓冲水溶液pH值小于多肽的等电点pI，并继续进行紫外/可见光谱的时间检测，直到紫外/可见光吸收不发生变化；即认为达到了释放平衡；

(2)  对特定多肽的提取与纯化

由于特定多肽具有确定的等电点(pI), 因此先将吸附剂SiO₂@PEI加入到含有目标提取多肽和干扰多肽的缓冲水溶液中，控制缓冲水溶液中的pH值大于目标提取多肽的等电点pI；经过1~48小时孵化，将吸附剂SiO₂@PEI分离并在该pH值下采用新鲜的缓冲水溶液洗涤，该吸附剂SiO₂@PEI所吸附的多肽以另一pH值低于pI的缓冲水溶液洗脱回收，该过程采用高效液相色谱(HPLC)或基质辅助激光解吸/离子化时间谱(MALDI-TOF)进行检测；基于等电点差异的提取方法通过切换pH值即可提取各类目标多肽，完全满足常规的分离要求。洗脱后的吸附剂可再利用。

本发明中，所述二氧化硅至少有一维尺寸在150微米以上，特别是300微米以上的二氧化硅，目的在于便于过滤或离心分离。 

本发明中，所述目标提取多肽与干扰多肽的浓度中的任意一种多肽的浓度不低于或等于1×10^-6摩尔/升时，采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。 

本发明中，所述目标提取多肽与干扰多肽中的任意一种多肽的浓度不低于或等于1×10^-15摩尔/升时，采用基质辅助激光解吸/离子化时间谱(MALDI-TOF)进行检测。