[发明专利]鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、猪、马、驴、牛、羊尤其是绵羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，以及相应的试剂盒，适用于上述六种动物骨组织制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿骨产品的快速防伪鉴定。

背景技术

鹿骨是我国传统中药，药用历史悠久。早在《本草纲目》中就有关于鹿骨“安胎下气，杀鬼精物，久服耐老，可酒浸服之。作酒，主内虚，续绝伤，补骨除风。烧灰水服，治小儿洞注下痢。磨汁涂面，光泽如玉。酿酒饮，肥白”的记载；《四川中药志》中也记载了其“治风湿四肢疼痛及筋骨冷痹”的功效。以梅花鹿骨为原料加工精制而成的鹿骨产品具有补虚、强筋、壮骨的功效，适用于久病体弱、精髓不足、贫血、风湿、四肢痛疼等症。

利用传统的理化方法无法区分以动物骨为原料所制成的骨产品等性质十分相似的产品，如鹿骨产品、猪骨产品等常见动物的骨制品。而现代分子生物学技术具有响应快速、灵敏度高的特点，如可利用聚合酶链式反应(PCR)从微量的DNA样品中扩增出特定的DNA片段，由于引物序列的差异性保证了实验结果的特异性极高，因此上述PCR技术目前已被广泛用于物种鉴定及检测的领域，在保证产品质量、打击假冒产品方面有着巨大作用。目前已有研究人员利用PCR技术进行了物种的鉴定及检测方面的研究，如本公司前期所申请的发明专利(CN102876805 B)建立了鹿及猪牛羊马驴兔鸡常见物种动物血液DNA的PCR鉴定技术。

但当采用从动物骨组织中直接提取总DNA的传统方法进行PCR鉴定时，由于从动物骨组织中提取总DNA时需要经过脱钙过程，而脱钙时间较长，通常需要一天的时间，对DNA抽提结果影响较大；且由于骨组织与血液的DNA组成差别巨大，血液中占绝大比例的红细胞不含基因组DNA，仅白细胞含有少量基因组DNA；而骨组织中基因组DNA占绝大比例，因此DNA成分更为复杂，极易对PCR结果造成干扰，实验检测中也证实了非特异性干扰的存在。因此本发明在前述发明的基础上，针对鹿猪马驴牛羊常见物种动物骨组织的cDNA的PCR条件进行了优化，并且对其中部分物种的鉴定引物进行了重新设计及有效性验证。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及基于该引物体系进行的鉴定方法和试剂盒可快速且特异性高的检测鹿猪马驴牛羊动物骨制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿骨产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛，可信度高；此外本方法是从骨组织中提取总RNA，再经过逆转录将RNA转为cDNA，用此cDNA作为鉴定PCR的模板，整个实验过程所花费时间大大小于从骨组织中提取总DNA并进行脱钙的时间，提高了检测鉴定的时间效率。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物，由下列引物对组成：

(1)对鹿线粒体12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’

反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’；

(2)对猪线粒体12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对II：

正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’

反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；

(3)对马线粒体16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对III：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’

反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；

(4)对驴线粒体16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对IV：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’

反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；

(5)对牛线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对V：

正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’

反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；

(6)对羊(绵羊)线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成羊(绵羊)特异性扩增片段的引物对VI：