[发明专利]一种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的病毒RNA小片段引物设计方法和以此方法设计的HCV RNA检测试剂盒，属于临床检验学领域。

背景技术

病毒RNA定量检测是病毒感染辅助诊断和疗效观察的重要依据。然而，诸多研究证实：病毒RNA在标本采集、运输、保存、检测前处理等过程中存在降解现象，若RNA降解，以目前的试剂盒来看，检测效率将普遍降低，进而影响诊断治疗。这是由于：以HCV为例，目前国内外检测HCV RNA的商品化试剂盒通常是扩增5’-UTR的150-250bp左右的片段。5’-UTR是HCV RNA的最保守序列，长341nt，其保守性使其成为引物设计最集中的区域。然而，商品化试剂盒通常忽略了5’-UTR的二级结构降解时对检测的影响。

HCV RNA的5’-UTR大部分序列自身互补，因而形成了充满了“茎环”的二级结构。①该结构存在热不稳定性，运输和保存中环境温度的变化会导致5’-UTR二级结构打开，使得靠近其5’端的序列容易被外切酶降解。目前商品化试剂盒检测片段普遍较长，不可避免地靠近5’端而易被外切酶降解，使得检测效率降低。

②该结构存在酶不稳定性，在“环”的区域常常比“茎”区更容易被多种内切酶降解，使RNA 5’-UTR被酶降解成长短不一的小片段。若引物刚好设计在“环”上充满酶切位点的区域，则当RNA被内切酶降解，引物无法和模板结合，检测效率也将降低。目前商品化试剂盒的检测片段普遍较长，不可避免地含盖诸多“茎”区而易被内切酶降解，使得检测效率降低。

因此，对于RNA降解标本，目前商品化试剂盒的检测效率都会有不同程度的降低，检测结果可能会影响用药和疗效观察，或者造成HCV RNA阳性献血者血液漏检。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是建立一种新型的病毒RNA检测的小片段引物设计方法。

本发明要解决的第二个技术问题是以HCV为例，用上述方法设计引物，建立HCV RNA小片段检测试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供上述试剂盒的应用，并和其他试剂盒进行检测性能比较。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种病毒RNA检测引物的设计方法，由以下原则组成：

(1)选择病毒基因组RNA最保守区域，通常为5’–UTR区进行引物设计；

(2)将该病毒各型别在5’–UTR区的共同序列作为引物设计的选择区域，并将共同序列在二级结构中定位；

(3)共同序列中位于5’–UTR二级结构的“茎”上的区域作为引物设计的首选区，尽量避开“环”结构；

(4)正反引物设计应尽量靠近5’–UTR的3’端；

(5)将最靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为forward引物互补区；

(6)将第二靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为probe探针的互补区；

(7)将第三靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为reverse引物；

(8)forward引物、probe探针、reverse引物之间不要有重合区域；

(9)扩增的目的片段跨越的“环”越少越好，即目的片段越小越好。

所述(1)的5’-UTR的二级结构为各RNA病毒专属的、国际公认的二级结构。

所述(2)共同序列是该病毒各亚型的RNA序列通过clustalX多重序列比对程序比对所得的共同序列。

一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，包括引物序列、探针序列和阳性序列，其中引物序列为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，探针序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明通过对HCV RNA的5’–UTR区不同位置的引物设计，发现在HCV RNA降解的患者血清中，目的片段为小片段的检测效率明显高于长片段；并用上述最小片段的引物建立了相应的检测试剂盒。

一种HCV病毒RNA检测试剂盒，由以下检测试剂组成：

(1)HCV RNA提取试剂：

1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；

2)RNase inhibitor：含有RNase抑制剂的溶液；

3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；

4)漂洗液：含有75％的乙醇的溶液；

5)洗脱液：RNase free water；