[发明专利]一种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒

权利要求书

1.一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于由以下原则组成：

(1)选择病毒基因组RNA最保守区域，通常为5’–UTR区进行引物设计；

(2)将该病毒各型别在5’–UTR区的共同序列作为引物设计的选择区域，并将共同序列在二级结构中定位；

(3)共同序列中位于5’–UTR二级结构的“茎”上的区域作为引物设计的首选区，尽量避开“环”结构；

(4)正反引物设计应尽量靠近5’–UTR的3’端；

(5)将最靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为forward引物互补区；

(6)将第二靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为probe探针的互补区；

(7)将第三靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为reverse引物；

(8)forward引物、probe探针、reverse引物之间不要有重合区域；

(9)扩增的目的片段跨越的“环”越少越好，即目的片段越小越好。

2.根据权利要求1所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于：所述(1)的5’-UTR的二级结构为各RNA病毒专属的、国际公认的二级结构。

3.根据权利要求1所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法，其特征在于：所述(2)共同序列是该病毒各亚型的RNA序列通过clustalX多重序列比对程序比对所得的共同序列。

4.一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，其特征在于：包括引物序列、探针序列和阳性序列，其中引物序列为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，探针序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

5.一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于由以下检测试剂组成：

(1)HCV RNA提取试剂：

1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；

2)RNase inhibitor：含有RNase抑制剂的溶液；

3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；

4)漂洗液：含有75％的乙醇的溶液；

5)洗脱液：RNase free water；

6)RNA吸附柱；

(2)OneStep RT-PCR荧光检测试剂：

1)PCR反应液(PCR buffer)；

2)dNTP混合液(dNTP mix)；

3)引物A(primer forward)：5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’(SEQ ID No.1)；

4)引物B(primer reverse)：5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’(SEQ ID No.2)；

5)荧光探针(probe)：5’-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3’(SEQ ID No.3)，探针标记：5’荧光基团是FAM标记，3’淬灭基团是MGB标记；

6)酶混合物(Enzyme Mix)：含有Taq酶和逆转录酶；

(3)对照品

1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；

2)强阳性对照：含有3×10⁷的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA(SEQ ID No.4)；

3)弱阳性对照：含有3×10³的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA(SEQ ID No.4)。

6.根据权利要求5所述的一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于：所述(2)中引物A为5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’，是根据本发明的引物设计原则选出的最靠近5’–UTR的3’端区域的互补序列。

7.根据权利要求5所述的一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于：所述(2)中引物B为5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’，是根据本发明的引物设计原则选出的第三靠近5’–UTR的3’端的序列。