[发明专利]一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体地说，是一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法。

背景技术

核酸适配体（aptamer）是一种通过结构特异性识别靶分子的单链寡核苷酸（ssDNA或RNA）。其作用原理与抗体相似，同时又具有无免疫原性、可化学合成、易改造、成本低、稳定性好等优点，在临床诊断、新药开发以及基础研究中有着广阔的应用前景。

Aptamer筛选技术被命名为指数富集的配体系统进化技术，简称SELEX（Systematic evolution of ligand by exponential enrichment），是在20世纪90年代初发展起来的一种组合化学新技术。其基本思路是：体外构建寡核苷酸文库并与靶分子结合，通过特定的方法分离出与靶分子结合的核酸，借助PCR技术指数富集，经过反复筛选与扩增（一般为5-18个循环），最终获得与靶分子高亲和力、高特异性结合的aptamer。

SELEX筛选过程中的关键步骤是游离核酸与能同靶分子结合核酸的分离。靶分子的性质不同，分离方法也相应不同。经过十几年的研究，在结合了其它新技术的基础上，发展出了许多新的SELEX筛选方法，为高效获得特异性aptamer提供了更多选择。

甲胎蛋白（AFP）是肝肿瘤最常用的标志物之一，其血清水平的升高通常预示着肝癌的发生。目前临床和科研中对AFP定性和定量的检测大都借助于抗体，灵敏度和特异性虽较高，但抗体存在着如成本高、具有免疫原性等缺点。Aptamer被称为“人工替代抗体”，若能筛选到特异性结合AFP的aptamer并取代抗体，就可以降低成本，同时还可以解决抗体批间差异大、不易保存和运输等问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

所述的筛选方法包括以下步骤：设计并构建大容量随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物，通过以毛细管电泳为基础的SELEX方法，富集能与AFP结合的寡核苷酸，最终经克隆、测序以及验证后得到与AFP特异性结合的寡核苷酸，即aptamer。

所述的随机寡核苷酸文库以及上、下游引物序列为：

随机寡核苷酸文库的序列如SEQ ID NO.1所示；

上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

随机区域为35个碱基的寡核苷酸文库的容量理论上为4³⁵，构象丰富，可以筛选出任何靶分子的aptamer。

所述的以毛细管电泳为基础的SELEX方法包括以下步骤：随机寡核苷酸文库与AFP共同孵育，混合物进行毛细管电泳，寡核苷酸与AFP结合后所形成的复合物在毛细管柱中的迁移率不同于未与靶分子结合的寡核苷酸，因此与AFP特异性结合的寡核苷酸被分离出来，收集与AFP结合的寡核苷酸，常规PCR扩增，制备单链DNA文库，文库纯化后用于下一轮筛选。

所述常规PCR扩增条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，30 s，扩增10个循环；72 ℃，5 min。扩增循环数的确定应在预实验中进行优化，选取条带亮度和特异性好的循环数。

所述单链DNA文库制备方法包括以下步骤：在链霉亲和素偶联的磁珠中加入常规PCR扩增产物，常温孵育，通过双链DNA上的生物素与磁珠上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA吸附到磁珠表面，洗涤磁珠后加入碱液，常温变性，含有单链DNA的上清液用弱酸中和，产物PAGE切胶纯化。

所述的SELEX筛选的次数为4次。

所述的磁珠与PCR产物的孵育时间控制在20-30 min，碱变性时间控制在5-10 min。

本发明优点在于：

本发明提供的筛选方法依赖于毛细管电泳本身的高效性，由此每次分离都获得了具有强相互作用的寡核苷酸；其次，由于靶目标为自由态，不存在基质的干扰，不必为由基质引起的非特异作用而增加工作量。因此，常规筛选需要通过8～15次循环才能达到的选择性，本发明经过4次循环就可以实现，仅需2～4天即可完成。经毛细管电泳检测和免疫荧光验证，筛选到的aptamer能与AFP特异性结合。

附图说明

附图1是本发明实施例中毛细管电泳筛选AFP特异性aptamer的第一轮电泳图谱。

附图2是本发明实施例中毛细管电泳验证aptamer-273与AFP蛋白的结合能力及特异性的检测结果。