[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程及酶工程的技术领域。具体的说，本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备技术领域。

背景技术

木聚糖是由多个吡喃木糖基通过β-1,3或β-1,4木糖苷键连接而成的多聚分子，其支链由乙酰基、L-阿拉伯糖残基、4-甲基-D-葡糖醛酸等取代基构成，是植物半纤维素的主要成分之一（周晨妍, 邬敏辰. 木聚糖酶的酶学特性与分子生物学. 生物技术, 2005, 15(3): 89-92；Biely P. Microbial xylanolytic systems. Trends in Biotechnology, 1985, 3(11): 286-290）。木聚糖的降解需要木聚糖酶的作用，木聚糖水解酶系主要包括主链上的水解酶β-D-1,4内切木聚糖酶（EC 3.2.1.8，简称木聚糖酶）、β-D-1,4外切木糖苷酶和侧链上的水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等，这些酶中，木聚糖酶对木聚糖降解起主要作用（范志恒, 李鹂. 体外模拟消化研究不同来源木聚糖酶对麸皮降解的影响. 饲料广角, 2011, (2): 33-34）。

由于木聚糖酶降解木聚糖纤维的作用，使得木聚糖酶在许多行业领域都有了很重要的应用：在造纸工业上，可以用于漂白纸浆、减少环境污染；在食品行业中，可以用来生产功能性低聚木糖、烘烤食品的发酵处理、酿酒澄清等；在饲料领域上：可以作为饲料添加剂加入饲料，消除饲料里木聚糖的抗营养作用，提高饲料的利用率及营养价值；在能源方面，可以降解木聚糖得到木单糖，进一步用木糖发酵生产燃料乙醇；在医药行业中，木聚糖经木聚糖酶降解的木单糖或二糖可以和其它物质共同使用延缓药物成分的释放。

目前，市售木聚糖酶主要来源于可培养的环境微生物，如白腐真菌、里氏木霉、黑曲霉、类芽孢杆菌等（李天歌, 岳晓禹, 李自刚, 等. 白腐真菌产木聚糖酶降解半纤维素及改善肠道微生态平衡作用. 食品科学, 2013, (17): 313-316；郑丽丽, 盛占武, 韩冰莹, 等. 不同诱变方法对黑曲霉产木聚糖酶能力的影响. 生物技术通报, 2013, (12): 146-150；蔡少丽, 杨章萍, 黄建忠. 里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及酶学性质. 食品与发酵工业, 2013, 39(8): 113-118；包怡红, 李雪龙. 木聚糖酶产生菌—类芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究. 中国食品学报, 2008, (2): 36-41）。普遍认为，可培养微生物只占自然界微生物的1％，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的木聚糖酶资源，其中很可能存在高活力的木聚糖酶。反刍动物瘤胃是一个降解植物纤维的高效厌氧发酵罐，存在大量不可培养的微生物，包括细菌、真菌和原虫等。瘤胃微生物通过产生纤维素酶和半纤维素酶来降解植物纤维，并未宿主提供能源。到目前为止，人们对来源于反刍动物瘤胃微生物木聚糖酶基因资源的研究寥寥无几。

Xue（1993）在专利WO93/25671中描述了从瘤胃厌氧真菌Neocallimastix patriciarum中分离木聚糖酶基因以及基因表达的方法，该木聚糖基因在大肠杆菌中表达的水平最高为672U/mg；经截短表达后，其中的一个克隆表达的木聚糖酶活力达到1 229U/mg。Geoffrey et al（1993）则在WO93/25693中记载了从瘤胃厌氧真菌N. patriciarum中分离木聚糖酶基因xynA的过程，在大肠杆菌中表达后，纯化的木聚糖酶比活力达到5 980U/mg。虽然重组木聚糖酶的活力较原始出发菌有较大提高，但要用于工业化生产仍然还有一定距离。