[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌和代谢的重组木聚糖酶及其制备

权利要求书

1.一种高表达木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm，该基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm菌种保藏编号为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）CGMCC No. 9398。

2.一种如权利要求1所述高表达木聚糖酶的基因工程菌GS115/pPIC9K-Xyn11Bm的基因序列，其特征在于，所述基因序列是一种源于人工合成编码的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B优化的核苷酸序列Xyn11Bm，长度为1014bp，序列如SEQ ID  NO：1所示。

3.一种能在毕赤酵母中高效表达的产木聚糖酶基因序列SEQ  ID  NO：1，此序列是在SEQ ID  NO：2序列基础上定点诱变而成，所编码的氨基酸密码子可以在巴斯德毕赤酵母中有效表达，该人工合成的DNA共编码337个氨基酸残基，氨基酸残基排列顺序如SEQ ID No.3 所示。

4.根据权利要求2所述优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11Bm的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9K-Xyn11Bm。

5.一种优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据酵母密码子偏爱性对Xyn11B的密码子进行初步替换；

（2）采用Oligo 6.0分析替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、EcoR I和Not I的切割位点；

（3）采用BioEdit 7.0分析调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、PolyT和PolyA，并计算GC百分比，再根据GC百分比对密码子最进一步调整，使其处于40-50%之间；

（4）采用RNA Structure 3.2对mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列SEQ ID No. 1，并命名为Xyn11Bm；

（5）采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 1所示核苷酸序列；

（6）构建含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-Xyn11Bm；

（7）将重组载体pPIC9K-Xyn11Bm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达；

（8）纯化所表达的木聚糖酶。

6.一种如权利要求5所述获得Neocallimastix frontalis木聚糖酶。

7.权利要求5 所述优化的Neocallimastix frontalis木聚糖酶用于非治疗目的降解木聚糖的应用。