[发明专利]一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法

说明书

本发明涉及一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。首次揭示在土霉素生产菌株中，下调lsigB基因后，能够显著地提高土霉素生产菌株的土霉素产量，单位菌体的土霉素合成量可提高20％以上。本发明为土霉素生产菌株改造提供了一个新途径。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。

背景技术

链霉菌的生命周期很复杂，能够产生多种次级代谢产物。这些天然产物为新药的发现提供了丰富的前体物资源。至1995年为止，由链霉菌中得到的具有抗生素活性的次级代谢产物约有7000种。链霉菌产生的抗生素在医药和生命科学研究中得到广泛应用。链霉菌以其特有的发育分化特征和强大的次级代谢能力，在基础研究与工业应用方面均具有重要地位。抗生素的合成与大量调控因子相关，这些调控因子通过调控抗生素合成途径中的相关基因的表达量，调控了抗生素的产量。这为进一步利用这些调控因子作为靶点进行基因改造，获得抗生素高产突变菌株，从而实现抗生素产量的提高提供了肯能。

龟裂链霉菌(Streptomyce rimosus)是土霉素(oxytetracycline，OTC)的商业化生产菌株。土霉素属于四环素类广谱抗生素，能够抑制对革兰阳性菌、阴性菌、支原体、衣原体、立克次体等引起的感染，同时也可用于治疗梨形虫病、附红细胞体病。其作用机理是土霉素能够可逆性地与30S核糖体亚基结合，从而抑制氨酰tRNA核糖体复合体的形成，这样抑制了细菌的繁殖。因此研究人员不断应用分子技术对S.rimosus进行研究，利用重组技术改造菌株性能、提高抗生素产量，或者以此为骨架合成生产非天然新抗生素。然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究提高土霉素产量的方法。

链霉菌的次级代谢产物的生物合成基因常位于同一基因簇中，在基因簇中常包含一个或多个途径特异性调控基因，它们一般调控一种抗生素或几种具有某些共同生物合成途径的抗生素的生物合成。抗生素生物合成基因簇的调控是受位于基因簇的转录调控子(CSR)在转录水平上进行调控的，通常有单转录调控子调控和多转录调控子调控。

但是，鉴于链霉菌的次级代谢调控网络十分复杂，定位到对于土霉素产量确实有调控作用的基因、且调节该基因的表达对于链霉菌自身生长不造成重大影响的基因仍然是困难的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产土霉素的方法，所述方法包括：

(1)在土霉素生产菌株中，下调lsigB基因(类sigB基因，like-sigB)的表达；

(2)培养步骤(1)制备的菌株，从而生产土霉素。

在一个优选例中，通过阻断(较佳地为插入阻断)或敲除lsigB基因，从而下调土霉素生产菌株中lsigB基因的表达。

在另一优选例中，在土霉素生产菌株中lsigB基因位置插入外源基因，从而阻断lsigB基因(较佳地，在该基因中第181-680位区间内插入外源基因)。

在另一优选例中，所述的外源基因包括pKC1139质粒中的部分元件，例如ori T、Ori pSG5、Apr。

在另一优选例中，所述的阻断lsigB基因方法包括：提供表达载体，所述表达载体中包含lsigB基因的部分序列(较佳地为第181-680位序列)，将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源基因序列片段的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，所述的土霉素生产菌株是链霉菌。

在另一优选例中，步骤(2)的培养方法包括：培养链霉菌孢子以形成菌丝细球，之后接种至发酵培养基中，30±2℃(较佳地30±1℃)，220±50rpm(较佳地220±20rpm)发酵。