[发明专利]草甘膦抗性提高的葡萄EPSPS突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种采用DNA分子重排（DNA Shuffling）技术获得了草甘膦抗性增强的来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。所述突变体含有7个突变位点，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的碱基序列如SEQ ID No.2所示。试验表明，本发明的来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码的基因，同时具有较高的草甘膦抗性和较强的与PEP亲和性，这些特性将为该基因用于抗草甘膦转基因作物的培育提供了可能。

技术领域

本发明属微生物领域，涉及一种来源于葡萄(Vitis vinifera)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶/EPSPS)多位点突变体及其编码基因与应用，具体涉及一种利用DNA分子重排(DNA Shuffling)和功能互补法对来源于葡萄EPSP合酶基因进行改造获得多位点突变体，然后将其编码的基因应用于草甘膦的抗性研究以及水稻转化、转基因作物培育中。

背景技术

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。EPSP合酶是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate，EPSP)和无机磷。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有II型的农杆菌CP4的EPSPS基因。然而由于该基因来源于细菌，因而容易引起普通消费者的心理顾忌。最近有学者报道了来源于可食性植物的EPSPS基因在转基因作物中表现出了良好的草甘膦抗性(Plant Physiol 140:184-195)，这就为发展抗草甘膦转基因作物提供了一种新的途径即以植物源的EPSPS基因来为基础来发展抗草甘膦转基因作物。但是来源于植物的野生型EPSPS基因往往对草甘膦很敏感，因而不能直接用于转基因作物的培育。这就需要通过基因工程手段对其进行改造，从而获得新型的来源于植物的功能良好的可用于转基因作物培育的新型基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于葡萄的EPSP合酶多位点突变体及其编码基因与应用。通过采用DNA分子重排(DNA Shuffling)获得该EPSP合酶多位点突变体文库，然后利用大肠杆菌aroA突变株(ER2799)的功能互补对来源于葡萄的EPSP合酶突变体文库进行筛选，获得了一个含有7个氨基酸突变的多位点突变体，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。经试验验证，该突变体不但在大肠杆菌中表现出显著地高草甘膦抗性，而且在转基因植物中也表现出了稳定的草甘膦抗性。

为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现：

首先，申请人在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)输入5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and Vitis vinifera,得到序列号为NM_001281247的编码葡萄5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的mRNA序列。根据此序列设计一对PCR引物(VvEPSPSZ和VvEPSPSF)，以本试验保存的巨峰葡萄cDNA文库(西北植物学报,2009,29:1723-1729)为模板，RT-PCR扩增获得葡萄EPSP合酶基因(VvEPSPS)的全长cDNA序列。