[发明专利]用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及胚胎工程领域，具体涉及用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒。

背景技术

在家畜繁殖上，卵巢来源的卵母细胞是生产动物胚胎的主要来源之一，因此卵母细胞体外成熟对于动物育种、克隆以及转基因动物生产是一个重要的平台技术。

2003年，王旭光对比了不同季节新疆绵羊卵母细胞在不同FSH、LH浓度下体外成熟的效果，并发现绵羊卵母细胞体外成熟的培养时间以24～26h为宜，同时探索了不同的EH和电激活方案对卵母细胞体外成熟的影响，发现EH+A23187+CHX是最适绵羊卵母细胞激活方案，卵裂率达到69.8％，囊胚率达到30％(王旭光.绵羊卵母细胞体外成熟和孤雌激活的研究[D].新疆：新疆农业大学,2003)。吕自力等于2004年按不同分布对绵羊卵母细胞进行了分级，并研究了在同样的体外培养条件下，不同级别的卵母细胞的成熟率，结果证明卵丘—卵母细胞复合体(COCs)的成熟率最高，达到68.9％(吕自力，马育芳，帅志强等.不同级别绵羊卵母细胞在春季体外培养条件下的成熟率比较[J].黑龙江畜牧兽医,2004,05)。2006年，王宝珍通过试验证明绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养时间以24h为佳,FCS浓度以20％最适宜(王宝珍.绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究[J].甘肃畜牧兽医,2006,05)。同年，孙桂金研究了FSH/LH浓度、年龄和采卵季节对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:FSH/LH能促进绵羊卵母细胞体外成熟，添加量以10μg/ml为宜；成年绵羊卵母细胞成熟率高于性成熟前绵羊，但无显著差异；发情季节绵羊卵母细胞较乏情季节易成熟。(孙桂金,尹逊河,敖红.绵羊卵母细胞体外成熟的研究[J].中国草食动物,2006,05)。同时，万鹏程等人还发现在绵羊体外成熟培养系统中添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.01)提高绵羊卵母细胞的体外成熟率，证实了VEGF对绵羊卵母细胞的体外成熟具有调节作用(万鹏程,罗海玲,张小红.血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟及体外受精卵卵裂率的影响[J].中国畜牧杂志,2006,23)。2008年，张晓建等人发现体外成熟培养19～21h的绵羊卵母细胞在成熟率上显著高于体外成熟培养16～18h(P<0.05)(张晓建,安志兴,李学斌.卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响[J].安徽农业科学,2008,32)。刘丑生等人于同年研究了EGFI、GF-I以及EGF和IGF-I联合对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响，结果表明:50ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分别为71.2％和45.5％,显著高于对照组和10、20、304、0ng/mL组(P<0.05),当EGF浓度达到100ng/mL时,成熟率和卵裂率最高,分别为72.9％和45.7％(刘丑生,陆会宁,张利平.EGF和IGF-I对绵羊卵母细胞体外成熟和卵裂的影响[J].畜牧兽医学报,2008,05)。2013年，徐燕霞在成熟液中分别加入BMP15、FGF8b，以成熟液作为对照组，对不同培养液的卵母细胞的成熟率和早期胚胎的发育情况进行比较。实验结果表明，成熟液中添加BMP15，卵母细胞的成熟率和胚胎发育情况明显高于对照组和添加FGF8b组，差异极显著(P<0.01)；对照组和添加FGF8b组卵母细胞成熟率和胚胎发育情况差异不显著(P>0.05)(徐燕霞.BMP15、FGF8b对绵羊卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育影响的初步研究[D].甘肃：甘肃农业大学,2013)。2014年，刘春霞等人通过实验证实了添加10％～15％ESS,10μg/mLFSH,20μg/mLLH,1.5μg/mL17-β E2,100IU青霉素,100IU链霉素的TCM-199成熟培养液能较好地促进绵羊卵母细胞体外成熟(刘春霞,赵瑞媛,周欢敏.绵羊卵母细胞体外受精培养体系的建立与优化[J].内蒙古农业大学学报,2014,01)。

目前，常规的体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)虽然能够使卵母细胞在体外环境下完成减数分裂，但很难使核质同步成熟，得到的卵母细胞质量远不如体内成熟的卵母细胞，核质同步成熟成为亟待解决的问题。为了更好的模拟体内环境，研究者开发了更为科学的卵母细胞体外两步成熟培养方法，即首先将卵母细胞在含有一定量减数分裂抑制剂的培养液中培养一段时间，然后再移入体外成熟液进行正常成熟培养，这种方法能够延长细胞质成熟的时间，促进卵母细胞积累丰富的母源mRNA和蛋白质，尽可能达到核质同步成熟。