[发明专利]用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒

权利要求书

1.用于绵羊卵母细胞体外成熟的预处理液，其特征在于：在绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液中添加有绵羊小卵泡液。

2.根据权利要求1所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊小卵泡液的终浓度为10％(v/v)。

3.根据权利要求1所述的预处理液，其特征在于：所述绵羊卵母细胞体外成熟的常规培养液为含终浓度3mg/ml BSA的TCM199培养液。

4.一种绵羊卵母细胞体外成熟方法，其特征在于包括如下步骤：

1)从绵羊离体卵巢中采集绵羊卵母细胞；

2)将所述绵羊卵母细胞放入权利要求1～3任一所述的预处理液中进行预处理；

3)将预处理后的绵羊卵母细胞转移至体外成熟培养液中进行体外成熟培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养液的配方为：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml E2+10％(v/v)的FBS。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述绵羊卵母细胞指A级卵丘卵母细胞复合体和/或B级卵丘卵母细胞复合体；所述A级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、多层卵丘颗粒细胞包裹；B级卵丘卵母细胞复合体表现为胞质均匀、少于3层卵丘颗粒细胞包裹或部分裸露。

7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述的预处理的步骤如下：将A、B级COCs用所述预处理液清洗2次，然后放入预先在CO₂培养箱中平衡2h以上的所述预处理液中培养4h；培养条件为：含5％CO₂的空气，温度38.6℃，饱和湿度。

8.根据权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于：所述体外成熟培养的步骤如下：将预处理后的COCs转移到预先在CO₂培养箱中平衡2h以上的所述外成熟培养液液中培养26h；培养条件为：含5％CO₂的空气，温度38.6℃，饱和湿度。

9.权利要求1所述的预处理液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)从绵羊离体卵巢上1-3mm的卵泡中抽取卵泡液；

2)将抽取的卵泡液在14000rpm下离心10min，抽取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤；

3)所得滤液SFF与绵羊卵母细胞体外成熟预处理的常规培养液成分配制得到所述预处理液。

10.用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～3任一所述的预处理液。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：还包括体外成熟培养液，所述体外成熟培养液的配方如下：TCM199+10ug/ml FSH+1ug/ml LH+1ug/ml的E2+10％(v/v)的FBS。