[发明专利]一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种白及种子育苗技术，具体涉及一种采用液体悬浮培养方法对白及进行原球茎培养的方法。

背景技术

白及(Bletilla striata（Thunb.）Rchb. f.)为兰科白及属多年生宿根草本植物，肉质肥厚的假鳞茎供药用；总状花序具数朵花，花紫色或淡红色，花型较大，直径约5厘米，形态优美，具有很高的药用价值和观赏价值。

白及在自然状态下主要靠分株繁殖，繁殖系数较低；虽然能产生大量的种子，但是种子不易发芽。由于白及繁殖率低，无法适应规模化种植的需求。目前针对白及繁殖的研究主要集中于种子无菌辅助育苗和组织培养，该技术可以在短时间内得到大量的实生苗，是白及生产上快速有效的途径。

现有对白及组培均选用固体培养基，接种时将白及种子轻轻抖落在培养基的表面，但是由于白及种子呈粉末状，非常细小，操作时难以保证每个种子都能充分接触培养基或者种胚基部接触到培养基，造成生长条件差异，导致出苗不整齐，且转接操作烦琐、工作量巨大。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种操作方便、成本低的白及种子培养原球茎的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，该方法包括以下步骤：

（1）白及种子消毒；

（2）悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽培养基中，进行震荡培养；液体发芽培养基采用1/2MS培养基（即采用MS培养基中物质的大量元素浓度减半，其它试剂浓度同MS培养基）；液体发芽培养基中含有NAA 0.5-1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1；培养条件为暗培养，培养温度24-26℃，培养时间为30天；

（3）悬浮壮苗培养：将经步骤（2）悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗培养基中，进行震荡培养；所述液体壮苗培养基采用1/2MS培养基；液体壮苗培养基中含有NAA 1.0mg·L^-1、6-BA 1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1；培养条件为光照培养，光照时间为16h/d，光照强度为2000-2500lx，培养温度为24-26℃，培养时间为30-45天。

其中，步骤（2）中液体发芽培养基中NAA的优选浓度为0.5mg·L^-1。步骤（3）中培养时间优选30天。

步骤（1）中对白及种子消毒采用以下方法：将白及蒴果表面清洗干净，用洗衣粉洗涤5-10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5-7遍。

并可将步骤（3）悬浮壮苗培养后得到的白及原球茎转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固体培养基中进行生根培养。

本发明白及种子液体悬浮培养原球茎的具体步骤如下：

1. 白及种子消毒：将白及蒴果表面洗干净，用洗衣粉洗涤5~10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5~7遍。

2. 培养基配制：配制1/2MS +0.5mg·L^-1 NAA+30g·L^-1蔗糖的白及液体发芽培养基和1/2MS+1.0mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1 6-BA+30g·L^-1蔗糖的白及液体壮苗培养基，于高温条件下灭菌冷却后待用。

3. 接种：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在1/2MS +0.5mg·L^-1 NAA +30g·L^-1蔗糖的白及液体发芽培基中。

4. 悬浮发芽培养：将接种好的白及液体发芽培养基置于摇床中，震荡培养。培养条件为黑暗培养，培养温度为25±1℃，培养30天。

5. 悬浮壮苗培养：将悬浮培养发芽30天后的白及原球茎转接于1/2MS+1.0mg·L^-1NAA + 1.0mg·L^-1 6-BA+30g·L^-1蔗糖的白及液体壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件为为培养温度为（25±1）℃，光照强度2000~2500lx，光照时间16h·d^-1。震荡培养，培养时间为30-45天。