[发明专利]一种调节性表达目的基因的载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于基因治疗的表达载体，属于可调控表达领域，具体涉及一种调节性表达目的基因的载体及其制备方法和应用。

背景技术

胆固醇是生物膜的重要组成成分之一,在许多生命过程中发挥着重要作用。但血液中高水平的胆固醇会导致动脉粥样硬化、冠心病等严重疾病，早发动脉粥样硬化、冠心病是家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia,FH)的重要表现(VanCraeyveldE等,CurrPharmDes,17(24):2575-2591(2011))。

血液中70％的胆固醇由低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,LDL)和极低密度脂蛋白(verylow-densitylipoprotein,VLDL)携带(张锐,国外医学,老年医学分册,30(1):29-33(2009))。血液中的LDL的含量对血液中胆固醇的代谢有重要影响。

肝细胞是代谢LDL的主要细胞，也是唯一能够排泄胆固醇的细胞。肝脏内的低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor,LDLr)的活性对血浆中LDL水平起到最主要的调节作用，LDLR基因的转录受固醇调节元件结合蛋白(Sterolregulatoryelementbindingprotein,SREBP)通路调节(柳童斐等,中国细胞生物学学报,35(4):401-409,(2013))。

SREBP是一种属于基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucinezipper,bHLHZ-ip)家族的转录因子(Yokoyamaetal.,Cell75:187-197(1993))，在哺乳动物细胞内有3个成员：SREBP-1a、SREBP-lc和SREBP-2。它们对不同的靶基因有不同的选择性，其中主要激活LDL基因的是SREBP-2。

SREBP通路的机理是：当细胞内质网膜的胆固醇处于高水平时，内质网膜蛋白SREBP裂解激活蛋白(SREBPcleavageactivatingprotein,SCAP)的固醇敏感结构域(sterolsensingdomain,SSD)将会结合胆固醇，导致SCAP构象发生改变，SCAP会结合内质网膜蛋白胰岛素诱导的基因(insulininducedgene,Insig)，形成SREBP-2/SCAP/Insig复合物并保留在内质网膜，导致胆固醇的合成和代谢被阻断，血浆中的低密度脂蛋白不会被代谢；当内质网膜的胆固醇处于低水平时，SCAP从Insig解离，SREBP-2/SCAP从内质网膜迁移到高尔基体，细胞核中的核SREBP-2(SREBP-2n)增加，SREBP-2n特异性结合LDLR基因启动子中的胆固醇调节元件(sterolregulatoryelement,SRE)，从而促进LDLR基因的转录，进而促使血浆中的低密度脂蛋白通过LDLr路径进行代谢(KassimSH等,HumGeneTher,24(1):19-26(2013)；SudhofTC等,JBiolChem,262(22):10773-10779(1987)；KongWJ等,JMolMed(Berl),84(1):29-36(2006)；RadhakrishnanA等,ProcNatlAcadSciUSA,104(16):6511-6518(2007)；SunLP等,ProcNatlAcadSciUSA,104(16):6519-6526(2007))。

SREBP除了通过SREBP通路对LDLr的表达进行调节，还能对其他胆固醇或脂肪酸合成途径中的酶进行调节。研究表明，在转录水平上，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase,HMGCR)mRNA含量主要受到SREBP的调控。HMGCR是胆固醇合成的限速酶，SREBP通路与HMGCR降解通路是胆固醇代谢的两个主要负反馈调控机制(柳童斐等,中国细胞生物学学报,35(4):401-409,(2013))。SREBP对HMGCR的调节也与胆固醇调节元件SRE有关，SRE为基因启动子上一个约10bp的顺式作用元件，SRE不仅存在于LDLR基因启动子中，在某些编码胆固醇或脂肪酸合成途径中酶的基因启动子中，比如HMGCR基因和乙酰辅酶A合成酶基因的启动子中也有SRE的存在。SREBP通过SRE调节LDLR基因的转录或其他酶基因的转录，进而调节胆固醇或脂肪酸的代谢(Rawsonetal.,Mol.Cell.Biol.4:631-640(2003))。