[发明专利]一种青霉素酰化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种微生物发酵制备青霉素酰化酶的方法。

背景技术

青霉素酰化酶(penicillin acylase，简称PA)又称为青霉素酰基转移酶，是β-内酰胺类抗生素工业生产中较为关键的酶，用量很大。

青霉素酰化酶既是胞内酶又是胞外酶，可以通过产酶微生物的营养控制代谢及基因型改变，进行大规模的生产。青霉素酰化酶主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，报道最多的是关于埃希氏菌属大肠杆菌发酵生产青霉素G酰化酶。近年来的研究倾向于3个方面：利用物理或化学诱变方法、基因工程方法对产青霉素酰化酶的菌株进行改造，突变菌种的分离以及酶在不同的产酶宿主细胞中的克隆和表达。如利用紫外光诱变巨大芽孢杆菌可以获得酶产量增加4倍的突变菌株，利用重组DNA技术将编码青霉素酰化酶的基因导入宿主细胞中，构建了高产分泌型工程菌，但酶的应用性能还有待提升。

发明内容

本发明的目的是提供一种青霉素酰化酶的制备方法，该方法制备得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上。

为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。

一种青霉素酰化酶的制备方法，包括以下步骤：

a.取大肠杆菌，在35-40℃条件下制备一级种子和二级种子，所用种子培养基含有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl；

b.将步骤a制备的二级种子接种至发酵培养基中，在35-40℃培养15-30h，得到发酵液，所述发酵培养基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；

c.将步骤b制备的发酵液进行离心，弃去上清液，收集下层的菌体浓缩液，即得到青霉素酰化酶的粗品溶液；

d.将步骤c所得青霉素酰化酶的粗品溶液进行均质，絮凝，超滤浓缩，沉淀除去杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，在37-38℃条件下制备一级种子和二级种子。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，种子培养基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaCl 5-10重量份，去离子水1000重量份。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的3-9％。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的6％。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的温度为37-38℃。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的时间为26h。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，发酵培养基为每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaCl5-10g。

上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，所述微量元素水溶液的配比为：每升去离子水中含有FeCl₃·6 H₂O 3.24g，ZnCl₂0.22g，CoCl₂·6H₂O 0.24g，NaMoO₄·2H₂O0.24g，CaCl₂·2H₂O 0.12g，CuSO₄·5H₂O 0.20g，H₃BO₃1.0g，MgSO₄0.74g。

本发明所述方法，步骤a中制备一级种子和二级种子选择在35-40℃条件下进行，符合大肠杆菌的生长特性，在此范围内，菌体的密度会随着温度的升高而升高，在37-38℃是增长的速度最快，随后增长趋缓。

步骤b中选择的接种比例为3-9％，在此比例范围内发酵产量与接种量的比较高，尤其是当二级种子的接种量为发酵培养基体积的6％时，产出接种比最高。

步骤b中，二级种子在35-40℃条件下培养种子发酵速度较快，在37-38℃条件下发酵速度最快，发酵时间在15-30h内，时间太短发酵不充分，时间太长会产生菌体自溶，发酵时间在26h时发酵效果最好。

步骤a中，种子培养基的组成中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提供碳源，而NaCl提供无机盐。这种培养基适于培养细菌。

同样的，步骤b中发酵培养基的组分中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨和甘油主要提供碳源，而NaCl提供无机盐。选取这种培养基有利于菌体生长、代谢产酶。