[发明专利]一种用于检测基因突变的长度依赖探针制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体为可用于检测基因突变，包括单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CNV）和染色体数目异常的长度依赖探针的制备方法。

背景技术

检测基因突变是诊断遗传疾病的主要手段以及其他代谢、神经类疾病的重要辅助诊断手段。基因突变包括如单核苷酸多态性（SNPs）、拷贝数变异（CNVs）、基因片段重复和缺失（Ins/Del）、染色体数目异常、基因甲基化等。其中单核苷酸多态性（SNPs）、拷贝数变异（CNVs）和染色体数目异常是目前检测基因突变类型中的主要类型。

目前检测基因突变的技术手段以PCR技术以及PCR延生技术为主，PCR技术具有检测周期短、检测灵敏度高、检测结果准确率高、检测结果可靠。然而，PCR技术只能实现一个反应管分析一个基因位点，效率低，同时PCR技术对样本DNA质量的要求较高，对于低浓度低质量样本DNA常会出现假阴性或假阳性的结果，对于一些特殊样本DNA（CG含量高、位点部分甲基化）PCR技术也常显得能力邮箱。当前要对如众多不同的遗传、神经、心血管、脑血管疾病进行分子生物学专业的检测，前期样本分拣繁琐、检测工作量大。因此，基因突变检测急需一种高通量、快捷方便的检测方法。

常见的高通量检测基因突变的技术有基因芯片、多通道毛细管电泳、变性高效液相色谱分析、二代测序等。这些方法虽然能进行实现“单样品对应多项目”的检测，然而对“多样品对应多项目”方式的检测能力有限，其局限性主要在对检测样本DNA的要求高、检测结果的正确度取决于检测深度、成本高。为一次性获得多目标DNA产物片段，多采用较为廉价的多重PCR技术，但目标DNA造成引物序列间相互干扰和引物聚合体使该技术检测基因数目收到了很大的限制，一般不会超过10个。

2002年荷兰的Dr. Schouten JP创造了一种新的基因突变检测技术用于医学检测，该技术即多重连接依赖探针扩增技术（Multiplex Ligation dependent Primers Amplification，MLPA）其原理是针对不同的目标基因位点设计长度依赖探针对（图1），这种长度依赖探针对两序列的一端具基因特异性，它们与各自目标基因区域复性后仅留一缺口，于此同时所有长度依赖探针对中与目的基因不杂交的一端都接有相同的碱基序列（既通用引物序列，GS）用于PCR，这样当长度依赖探针对与目标区复性并在连接酶的作用下相连而本身成为PCR的模板DNA，并由一对通用引物扩增而达到信号放大的效果，由于针对不同的目标基因位点设计的探针对长度各不相同，通过分离PCR产物大小（无须通过测序手段，通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳即可达到分离的效果）便可知道是否有目标基因的存在，可以对目标基因进行定性分析，也能进行相对定量分析。

MLPA 技术具有操作简便（不需昂贵和复杂的操作设备）、特异性高（探针复性及连接酶的特异性识别）及高通量（单管可测多达45个基因位点）、需要DNA样本量低（仅需20ng/μl DNA）、应用领域广（可应用于单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CNV）、基因片段缺失和重复（Int/Del）、染色体数目异常、基因甲基化分析以及mRNA的分析）的特点。这几年来，已超过有上百篇的研究报告中应用了此技术。

在MLPA技术中涉及到针对目标基因的长度依赖探针对，其中长度依赖探针对的设计是难点，荷兰科学家创造性地利用了M13单链噬菌体的特性，巧妙地在插入衍生的序列两端设计了限制性内切酶（RE）识别位点，以便采用双酶切获得长度依赖探针对，克服了目前寡核苷酸化学合成一般难以达到50mer以上的困难。

其原理就是将各M13载体的大小不同的无关序列或无关的模板（Unrelated Template，UT）引入单链探针从而获得长度不同的单链探针。该单链探针生物方法非常繁琐，不仅需要基因克隆、病毒转染、质粒提取等过程，还必须购买一套昂贵的M13载体，此外，操作M13病毒极易发生污染。同时为了垄断MLPA应用市场，现在荷兰公司MRC-Holland已经不再出售M13载体，因此，长度依赖探针对的制备方法急待解决。

发明内容

本发明的目的是针对上述MLPA长度依赖探针对生物制备方法繁琐的问题，提供一种操作方法简便、污染可控、制备效率高的MLPA长度依赖探针对的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种用于针对心血管疾病相关风险基因的MLPA检测的长度依赖探针对以及心血管疾病风险基因的MLPA检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案（图2）：