[发明专利]一种用于检测基因突变的长度依赖探针制备方法

权利要求书

1.用于多重连接扩增技术的长度依赖探针对制备方法，包括长探针的制备和短探针的制备。

2.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的长度依赖探针对制备方法，其特征在于，所述的长探针的制备方法包括以下步骤：

1) 设计一对与待测靶片段及长探针中的天然序列无关的通用引物，GSF和GSR，用于最后的PCR 扩增检测；

2) 确定一段与长探针及通用引物无关的天然序列NS，并用于设计一对扩增长探针的引物，分别为GRS-N’和GSF-N’，其中GSR-N’是由GSR的序列与NS序列3’端的18bp左右的序列组成，TSR-N’由目的长探针5’端序列的反向互补序列与NS 序列5’端的18bp 左右反向互补的序列组成，并且TSR-N’的5’端要带上磷酸化修饰；

3) 用GRS-N’和GSF-N’以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR 扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

4）纯化回收PCR 产物；

5）采用T7核酸外切酶对以上dsDNA序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条ssDNA ；

6）根据检测设备的需要，对长探针的3’端进行报告基团的修饰；

7）采用ssDNA 纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到长探针。

3.根据权利要求2所述的用于多重连接扩增技术的长度依赖探针对长探针的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的天然序列NS，天然序列可以选用任何与目标基因片段和通用引物无关序列。

4.根据权利要求2所述的用于多重连接扩增技术的长度依赖探针对长探针的制备方法，其特征在于，步骤6）所述的报告基团的修饰，报告基团可以使用FAM、HAX、Cys5、Cys3。

5.根据权利要求2 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤3）所述PCR 扩增得到的5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行T7外切酶消化。

6.根据权利要求2所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤5）所述的T7外切酶消化过程中，1ugdsDNA用1个单位T7外切酶消化。

7.根据权利要求 1 所述的用于多重连接扩增技术的长度依赖探针对制备方法，其特征在于，所述的短探针的制备方法包括以下步骤：

1) 针对短探针的涉及一对扩增引物，分别为GSF-N’和TSF-N’，其中GSF-N’是由GSF的序列5’端的18bp左右的序列组成，TSF-N’由TSF序列3’端的反向互补序列中的18bp 左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；

2) 用GSF-N’和TSF-N’以所述的长探针的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；

3) 纯化回收PCR产物；

4) 采用T7核酸外切酶对以上纯化后的PCR产物的双链核苷酸序列进行消化，去除5’端磷酸化标记的那条ssDNA；

5) 采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化后产物进行回收，获得长度依赖探针对中的短探针。

8.根据权利要求7 所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤3）所述PCR 扩增得到的5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行T7外切酶消化。

9.根据权利要求7所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤5）所述的T7外切酶消化过程中，1ugdsDNA用1个单位T7外切酶消化。