[发明专利]一种重组蛋白rPmt4p及其表达与在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明属于医学和生物工程技术领域，具体涉及一种重组蛋白rPmt4p及其表达与在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。

背景技术

随着抗肿瘤放化疗、介入治疗、器官移植术后免疫抑制剂的广泛应用，尤其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的病人数量不断增加，侵袭性真菌感染已逐渐成为一种常见病、多发病，并已成为免疫功能低下人群死亡的主要原因。念珠菌是机会性致病真菌中的主要一属，其中白念珠菌(Candida albicans)的毒力最强，感染率最高，引起严重的侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)，死亡率高达40％。我国2013年最新统计数据表明，白念珠菌是侵袭性念珠菌血症的主要病原菌，占57％左右。

Pmt4p是白念珠菌细胞壁上的甘露糖蛋白(Protein mannosyltransferase)，Prill SK等人研究发现，在小鼠尾静脉注射5×10⁵PMT4基因缺失菌后与野生型对照组相比存活率是100％，证明了PMT4是与念珠菌菌丝生长及毒力有显著性关系的基因(Prill SK,et al.(2005)PMT family of Candida albicans:five protein mannosyltransferase isoforms affect growth,morphogenesis and antifungal resistance.Mol Microbiol 55(2):546-60)。

目前尚无文献报道用生物工程方法制备重组Pmt4p蛋白，也尚无文献报道Pmt4p蛋白用于预防或治疗侵袭性念珠菌感染的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白念珠菌细胞壁上的甘露糖重组蛋白rPmt4p，本发明的另一目的在于提供该重组蛋白rPmt4p的表达，以及该重组蛋白rPmt4p在制备防治侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。

本发明人研究发现，白念珠菌SC5314的细胞壁上的甘露糖蛋白Pmt4p(GENBANK NO：3644096)的301至520氨基酸序列，可用于制备一种治疗侵袭性念珠菌感染的蛋白疫苗。

本发明的第一方面，是提供一种重组蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二方面，是提供上述的重组蛋白rPmt4p在制备预防或治疗侵袭性白念珠菌感染疫苗中的应用。

本发明的第三方面，是提供一种预防或治疗侵袭性白念珠菌感染的蛋白疫苗，该蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

该蛋白疫苗是通过以下方法制备得到的：

A、克隆如SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

B、构建含有如SEQ ID NO:2所示的DNA序列的重组质粒；

C、在真核表达系统酿酒酵母INVSc1中表达如SEQ ID NO:1所示的重组蛋白(rPmt4p)。

步骤A中，克隆DNA序列，以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引物PMT4-Exp-F如SEQ ID NO:3所示，引物PMT4-Exp-R如SEQ ID NO:4所示。

步骤B中，构建重组质粒所用的质粒载体为PYES2/CT质粒。

本发明的具体技术方案如下：

1、Pmt4p蛋白表达基因的克隆

以白念珠菌SC5314基因组DNA为模板，引物PMT4-Exp-F：GCggatccATGTCTAGATCTGGCCCAGGTGATGC(SEQ ID NO:3)及PMT4-Exp-R：ATTTgcggccgcGAAATTCCAAATATTGTCC(SEQ ID NO:4)扩增，PCR扩增产物片段长度为660bp(SEQ ID NO:2)；

2、重组真核表达质粒的构建

将上述获得的重组Pmt4p基因片段插入到PYES2/CT质粒中，构建PYES2/CT-PMT4重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5α，重组质粒酶切鉴定正确后送测序，序列如SEQ ID NO:2所示，重组片段序列与Pmt4p蛋白301至520氨基酸序列完全一致。

3、阳性重组质粒DNA的转染

将酶切和测序结果都为阳性的重组质粒转染到表达菌株酿酒酵母INVSc1中。

4、菌落PCR鉴定阳性转染克隆