[发明专利]阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)，是奶粉中新发现的一种食源性条件致病菌。该菌能引起新生儿及婴幼儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等疾病，死亡率高达40％～80％。阪崎肠杆菌能引起各年龄段人群感染，尤其是对早产儿、出生体重偏低、免疫力低下的婴幼儿造成的危害是不可逆的。国际食品微生物标准委员会将其定为“严重危害特定人群，威胁生命或导致慢性实质性后遗症”的细菌。

研究发现阪崎肠杆菌广泛的存在于自然界中，目前已经从婴幼儿配方奶粉、奶酪、UHT杀菌乳、谷类食物、香肠、香辛料、蔬菜等食品中发现了阪崎肠杆菌。此外，阪崎肠杆菌还广泛存在于医疗环境中，食品加工厂各种仪器以及环境中。阪崎肠杆菌的广泛存在严重的威胁了人类的生命健康，因此迫切需要建立一些简单、高效、快速、准确的阪崎肠杆菌检测方法。

目前，应用于阪崎肠杆菌检测领域的方法主要有传统的微生物培养法和PCR检测方法。但是这些方法都存在检测周期长、操作繁琐等缺点，因而实现难以对污染源的快速诊断。近年来，微生物快速检测技术取得了突飞猛进的发展，其中基于单克隆抗体的免疫学检测方法呈现出了良好的应用前景。免疫学检测方法依赖于抗原和抗体间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量检测。免疫学检测技术具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、操作简单等特点，特别适合于大批量样本的检测，已广泛应用于食源性致病微生物的快速检测。

酶联免疫吸附检测方法(Enzyme-linked immuosorbent assay，ELISA)是目前免疫学检测方法中应用最为广泛，技术最为成熟的方法。ELISA以酶或者辅酶作为标记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，并且利用聚苯乙烯微量反应板吸附抗原或者抗体，使其固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA具有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点，弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。ELISA可以应用于致病菌快速检测，关于沙门氏菌、单增生李斯特菌的ELISA检测方法已经应用于食品的检测中。

然而国内外针对阪崎肠杆菌单克隆抗体的研究较少，迫切需要一种能够特异性识别阪崎肠杆菌的单克隆抗体制备技术，并将该单克隆抗体应用于ELISA检测技术，以实现对食品、临床及环境中阪崎肠杆菌的检测和监测。阪崎肠杆菌的外膜蛋白A(Outer membrane protein A，OmpA)在遗传上具有较高的保守性，并且暴露于菌体表面，具有高的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且还可诱导细胞介导的免疫应答，因而可作为一种良好的免疫原。

发明内容

技术问题

针对现有检测技术存在的不足，本发明的目的是通过基因工程的方法以及杂交瘤技术得到杂交瘤细胞株，并获得以阪崎肠杆菌OmpA为抗原的单克隆抗体，同时设计出了基于该单克隆抗体的酶联免疫检测试剂盒，为实现对阪崎肠杆菌的快速、灵敏、高通量的快速检测提供了检测手段与方法。

技术方案

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种杂交瘤细胞株，于2014年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞株C232C，保藏号为CCTCC NO：C2014102，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编为430072。

一种阪崎肠杆菌单克隆抗体，由以上所述的杂交瘤细胞株制备得到。

一种以上所述的杂交瘤细胞株的制备方法，按照以下步骤进行：

(1)阪崎肠杆菌OmpA蛋白的制备：采用PCR技术从阪崎肠杆菌基因组中扩增OmpA，克隆至表达载体中，IPTG诱导表达重组蛋白OmpA，经纯化后作为免疫原；

(2)动物免疫、细胞融合和杂交瘤细胞的选择：采用步骤(1)中的免疫原，对实验动物进行注射免疫，免疫后取实验动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞在融合剂存在的条件下进行细胞融合，测定效价，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株选择：

1)通过将参考菌株接种培养于LB或NB液体培养基中，在30℃或37℃下培养12h后，分别将参考菌株培养液离心收集菌体，用PBS缓冲液冲洗后加入甲醛进行灭活菌体，调整各菌体浓度至10⁸CFU/mL，获得阪崎肠杆菌及阴性参考菌株的细胞悬液；