[发明专利]一种肌酸水解酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌酸水解酶及其编码基因，以及该编码基因重组大肠杆菌制备肌酸水解酶的方法。本发明属于生物工程技术领域,本发明重组制备的肌酸水解酶产物属于医学诊断化合物，可以用于检测人体肾脏功能。

背景技术

人类的肌肉和大脑消耗的能量主要来自于磷酸肌酸的水解。磷酸肌酸与ADP在酶的作用下可形成ATP，同时生成肌酸，所形成的肌酸在体内最终将被转化成肌酐。此外，磷酸肌酸也会在体内直接脱去磷酸生成肌酐，肌酐经过肾脏的过滤由血液进入尿液而排出体外。健康肾脏的这一功能可保证将代谢过程中形成的肌酐不断地排出体外而使血液中的肌酐始终保持在一个较低的水平。如果肾脏发生病变，将不能有效地清除所形成的肌酐而造成肌酐在血液中积累。因此血液和尿液的肌酐含量可反映肾脏的排泄功能。肌酐测定主要有化学法和酶法。化学法有多种，但大都源于Jeffe早年建立的碱性苦味酸法，其优点是成本低，操作简单。该法虽然经济，但易受样品中的非特异性物质(假肌酐)的干扰，且敏感性差。

酶促方法是样品通过肌酐水解酶(creatinine amidohydrolase，E.C.3.5.2.10)、肌酸水解酶(E.C.3.5.3.3)、肌氨酸氧化酶(sareosine oxidase，E.C.1.5.3.1)的连续转化，肌酐完全被降解，该方法具有酶促反应的专一性强、灵敏度高、简便、快速等特点。

肌酸水解酶是酶促检测法中必不可少的一种酶，主要来源于微生物。1937年首次发现肌酐可以被微生物降解。随后发现一些属的菌株能够通过诱导产生肌酸水解酶并在细胞中累积。这些细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌(Clostridium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)等。国外针对肌酸酶的研究主要在以下几个方面：(1)原始菌产肌酸酶的产酶条件；(2)几种不同来源的肌酸酶基因的表达；(3)肌酸酶纯化和酶学性质研究。目前国外已生产出肌酐检测试剂盒，而我国在肌酸水解酶的研究上起步较晚，临床上的应用仍然主要依靠进口。

发明内容

本发明提供了一种肌酸水解酶高效生产和纯化制备的方法。在本发明中，提供了以基因工程技术克隆获取所述肌酸水解酶基因，构建大肠杆菌重组表达肌酸水解酶的工程菌及其生产方法。

本发明涉及克隆获得肌酸水解酶的全长基因序列，涉及构建所述的肌酸水解酶基因工程高效表达制备肌酸水解酶的方法，还涉及到本发明所述的肌酸水解酶作为水解酶在本文所述的医疗中的应用。

本发明提供了一种来源于节杆菌的肌酸水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述肌酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有权利要求2所述肌酸水解酶基因的质粒也属于本发明要求保护的范围。

含有上述重组质粒或肌酸水解酶的基因的基因工程菌或转基因细胞系均属于本发明要求保护的范围。

本发明中所述的肌酸水解酶(CRE)的基因克隆获取和重组制备方法如下：

1所述肌酸水解酶CRE全长基因的克隆获取。

2所述肌酸水解酶CRE基因重组大肠杆菌表达载体的构建。将所述制备方法1中的肌酸水解酶CRE基因利用引物CREF、CRER扩增，采用限制性内切酶酶切，连接至大肠杆菌表达质粒pET20b(+)，构建重组表达质粒pET20b-cre。

3将制备方法2所述的表达重组质粒pET20b-cre经化学转化法转入E.coliBL21感受态中。在添加有氨苄青霉素(0.1μg/mL)的LB平板上筛选阳性重组子，并用特异性引物CREF、CRER对阳性大肠菌落进行PCR验证肌酸水解酶CRE基因重组E.coliBL21(pET20b-cre)成功。

本发明还提供了一种发酵生产重组肌酸水解酶的方法：从甘油管中按0.4％的接种量将所述的工程菌接入20mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37℃，培养12h。发酵培养：将培养好的种子培养液按1％(v/v)的接种量接种至50mL/500mL三角瓶中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速200rpm；待OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达，培养10h。